专利名称：自动化核酸提取平台的制作方法
技术领域：
本实用新型属于核酸提取领域，具体为一种通用自动化核酸提取平台，该平台具有广泛的应用，可用于医疗、卫生、防疫、科研、技术监督等领域。
技术背景核酸是分子生物学研究的基本对象，核酸提取步骤是分子诊断中最为重要、最基本的一个环节。从生物样品中提取DNA或RNA的方法有很多种，例如传统的有机溶剂提取方法，以及可适合以96孔板模式进行高通量自动化操作的硅胶膜柱吸附法、磁珠分离法和电荷法等。其中，磁珠分离法是目前应用最广、自动化条件最为成熟的一种方法，例如Roche、·Chiron、Abbott、Gen-probe、Biomerieux等公司研发的分子诊断产品皆为基于磁珠分离法的产品。磁珠是一种新型的功能化固相载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固相、液相的分离变得十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。磁珠法核酸提取试剂一般由裂解液、磁珠、洗液、洗脱液等组分组成。裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物、微生物的细胞、病毒衣壳裂解，并使与核酸结合的蛋白质变性，核酸游离释放，磁球可以特异地吸附核酸，通过洗液洗涤，去除蛋白质等杂质，再因洗脱液解离吸附在磁珠上的核酸，得到纯度和浓度均很高的核酸，可用于PCR扩增、酶切、分子杂交等。核酸提取的过程以及所提取的核酸的质量对分子诊断的结果影响极大，如不能有效地完成核酸提取方面的工作，就不能进行分子诊断实验。在临床诊断实验室中，核酸提取的过程基本是手工完成，因其工作强度大，常常带来操作错误、交叉污染等问题。随着分子诊断的快速发展，在临床中，搭建一个自动化核酸提取平台显得越来越重要。一方面，国内生产的自动化核酸提取平台很少见，相关的专利文献更少见。目前可查到的类似专利文献有“一体化血液核酸筛查平台”(授权公告号CN201695047U)。另一方面，市场上的自动化核酸提取平台主要由国外厂家，例如Tecan、Hamilton、PE、Beckman等提供,大部分面向科研领域，由于其处理样品能力体积小(低于200 μ I/样品)、通量低(=48样品/批次)、与实验室信息化管理系统(LIMS)无法交互信息等问题，基本没有获得临床用户的认可，应用极少。其它适合临床分子诊断的自动化设备有Roche公司的MagNA Pure、Chiron公司的Procleix TIGRIS System等。然而，Roche 的 MagNA Pure 只适用于 Roche 的试剂，而 Chiron的Procleix TIGRIS System只适用于Chiron和Gen-probe的试剂,基本上是不开放平台。综上所述，本领域急需一种高通量、通用的自动化核酸提取平台来解决核酸提取的自动化问题。
发明内容本实用新型是提供一种自动化核酸提取平台。在该平台上，可实现磁珠法提取试剂的自动化提取过程，获得质量稳定可靠的核酸产物。在本实用新型的自动化核酸提取平台设计中，着重考虑了核酸提取平台的防止气溶胶形成、防止样本交叉污染、稳定性和自动化等方面的问题。在调研市场多家在售设备的基础上发现(1)液体工作站是一个成熟的平台，特别是Tecan、Hamilton等公司所提供的液体工作站加样精确、运行稳定、可选配机械手实现标准元件的移动操作，非常适于作为构建通用的核酸提取平台的基础；(2)半自动核酸提取仪在临床实验室中有较为广泛的应用，其临床使用情况显示，该类产品性能稳定、技术成熟、价格低廉、体积小巧，可作为独立工作单元与液体工作站联用。但是，在国内外尚无将液体工作站和核酸提取仪二者完全结合，形成一个概念全新的、完全自动化的核酸提取工作站的报道。在一些情况下，尽管已成功地将二者联合使用，但是在核酸提取过程中还需实验人员参与从液体工作站移动工作元件到半自动核酸提取仪的手工操作，不是完全意义上的自动化产品，再者，其设计中没有考虑防气溶胶形成和防污染设计。相比而言，本实用新型的最大特点在于将液体工作站和半自动核酸提取仪进行整合，将液体工作站的快速准确的加样功能和半自动核酸提取仪的高效的核酸提取功能有机结合起来，将两种设备整合于一个基座工作区，通过软件控制，构建出样本加样、试剂分装、核酸提取、PCR反应液配制等一系列全自动化操作的核酸提取平台。该设计不仅保证了核酸提取的速度，而且还在混匀方式和分离核酸设计中有效解决了防止气溶胶形成，极大程度降低了核酸污染问题。另外本实用新型还有其通用性、便利性、信息化等特点。通用性在于本实用新型属开放平台，不排斥任何厂家的磁珠法提取试剂，不仅能用于血液筛查，也可用于临床医院分子诊断实验，还可用于疾病控制中心、科研院所等机构；便利性在于本实用新型可处理的样品量从例如20μ l-2ml均可、批次通量可为例如24-96个样品、可连续批次进样等；信息化在于所有流程控制自带条形码扫描识别系统，由计算机软件控制全部流程，并自动记录存档，其结果可与实验室信息化管理系统(UMS)交互数据，实现实验室信息统一管理。本实用新型的自动化核酸提取平台包括基座工作区域和至少一个用于实现液体操作的液体加样臂和/或用于实现标准元件的移动操作的机械手。其中所述基座工作区域被划分为若干功能区，所述功能区包括但不限于样品区、耗材区、试剂区、中转区、核酸提取区和废弃物区。具体而言(I)样品区用于放置实验待检样品，所述待检样品位于样品区中的样品池内，所述样品池包括但不限于采血管、标准24孔板、标准48孔板、标准96孔板等。优选地，其中各样品池各自带有条形码，可被自动扫描识别确认。(2)耗材区用于放置实验所需的耗材，所述耗材包括但不限于吸头载架、深孔板和PCR板；吸头载架供放置专用吸头，深孔板用于核酸提取，PCR板用于扩增反应液的配制；优选地，各耗材各自带有条形码，可被自动扫描识别确认。(3)试剂区用于放置实验所需的试剂，所述试剂位于试剂区中的试剂载架上；优选地，各试剂各自带有条形码，可被自动扫描识别。(4)中转区设置有载架供放置包括但不限于深孔板、PCR板等元件用于样品加样、试剂添加、PCR反应液配置等操作；这些元件可通过机械手在中转区、试剂区和核酸提取区等区域进行转移。(5)核酸提取区用于放置实现核酸提取所需的核酸提取装置。该区为本实用新型的关键区域，在该区域放置半自动核酸提取仪为本实用新型的独特设计，半自动核酸提取仪采用了磁棒上下搅动的混匀方式。目前本领域的主要厂商所生产的设备多采用涡旋振荡混匀(例如，Tecan公司提供的用于个体识别系统的设备多采用此方式)和反复吹打混匀(例如，Hamilton提供的用于科研单位的设备多采用此方式)等混匀方式，这样的混匀方式容易产生气溶胶，导致核酸污染，不同厂家的试剂在此类平台上工作污染几率较高，约为O. 5%-10%。与上述其他混匀方式相比，所述磁棒上下搅动的混匀方式具有气溶胶形成几率低、交叉污染小等优点。另外，不同于常规的吸弃废液的做法，本实用新型提取区的半自动核酸提取仪将提取废弃液静止放在原耗材中，通过分离转移磁珠的方式实现核酸分离，因此，较之传统吸弃液体的方式，本实用新型具有气溶胶形成几率低、实验环境污染小的优点。在本实用新型的一个实施方式中，所述核酸提取区的半自动核酸提取仪可选用但不限于KingFisher Flex磁珠分离纯化系统、MagMAXExpress核酸抽提系统,优选为KingFisherFlex磁珠分离纯化系统。(6)废弃物区用于放置实验中所产生的废弃物，例如固体废弃物和/或液体废弃·物；优选地，所述废弃物区中可包括废弃吸头收集桶、废液槽等。上述功能区可根据应用情况进行调整，各工作区的元件数量可根据应用情况进行增减。优选地所述各功能区位于所述基座工作区域的X轴与Y轴组成的平面上，按照附图所示的顺序排列。这样既将各个工作区相对独立分开，避免样本区、核酸提取区、试剂区等区域的相互污染，又可最大化节约工作基座空间。除上述6个功能区外还可增加其他功能区域，如封膜区用于将深孔板和/或PCR板进行封膜处理。在Z轴方向上(即所述基座工作区域的平面上方)为液体加样臂和/或机械手，其中所述液体加样臂上带有移液装置(例如加样器)，可对所述基座工作区域上的元件进行移液操作，其可在X、Y、Z轴上运动；所述机械手可对所述基座工作区域上的元件(例如深孔板)进行移动操作，可在X、Y、Z轴上运动。在本实用新型的核酸提取平台的使用过程中，由软件控制完成例如下列步骤样品的自动扫描和计数、将反应池置于中转区中、将试剂和/或样品加入反应池中、将反应池转移到核酸提取区中进行核酸提取等。本实用新型的核酸提取平台的核酸提取过程自动化程度高、操作方便，优选地，所述核酸提取平台操作软件数据库系统，能够与实验室信息化管理系统(UMS)交互数据，实现实验室管理标准化。此外，利用本实用新型的核酸提取平台可处理的样品可以是任何包含核酸分子的物质，包括但不限于痰液、尿液、血清、血浆、组织匀浆物、脑脊液、培养物等。经由本实用新型的核酸提取平台处理后的产品可用于PCR、RT-PCR、TMA, NASBA、3SR、LCR、酶切反应、连接反应、转化、转染等分子实验。此外，由于本实用新型的核酸提取平台能够实现实验的自动化、信息化，降低了检验人员的工作强度，极大地减少了检验人员的误操作，并且便于数据的统一管理。以下将结合具体实施方式
和附图，进一步阐释本实用新型的核酸提取平台。本领域人员将会了解，下述内容仅仅旨在更好地描述本实用新型的精神、思想，而不会成为对本实用新型的限制。此外，依据本说明书的描述，本领域技术人员将容易地了解，本实用新型的许多变化形式均不会超出本实用新型的主旨精神，而落入本实用新型的保护范围内。
图1 :自动化核酸提取平台平面示意图图中标号I样品区2耗材区 3试剂区4中转区5核酸提取区6废弃物区7KingFisher Flex磁珠分离纯化系统8试剂储存低温模块①样品架②吸头废弃存放处③液体废弃存放处④96孔深孔板⑤96孔深孔板及96头磁头套管⑥PCR 板⑦试剂槽⑧磁珠存放架⑨1000 μ I 吸头⑩200 μ I 吸头具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明实施例1 :选用Tecan FREEDOM EV0_2100/150/200Bace 液体工作站和 KingFisher Flex 磁珠分离纯化系统进行组合，设置样品区、耗材区、试剂区、中转区、核酸提取区、废弃物区等6个功能区。(I)样品区用于放置实验待检样品，样品池为采血管或标准24孔板、标准48孔板、标准96孔板等。各样品池各自带有条形码，可被自动扫描识别确认。(2)耗材区用于放置实验所需的耗材，所述耗材包括吸头载架、深孔板和PCR板；吸头载架供放置专用吸头，96深孔板用于核酸提取、PCR板用于扩增反应液的配制；各耗材各自带有条形码，可被自动扫描识别确认。(3)试剂区用于放置实验所需的试剂，如磁珠法核酸提取试剂、PCR反应液等，所述试剂位于试剂区中的试剂载架上；各试剂各自带有条形码，可被自动扫描识别。(4)中转区设置有载架供放置包括深孔板、PCR板等元件用于样品加样、试剂添加、PCR反应液配置等操作；这些元件可通过机械手在中转区、试剂区和核酸提取区等区域进行转移。(5)核酸提取区设置KingFisher Flex磁珠分离纯化系统进行核酸提取。[0051](6)废弃物区中可包括废弃吸头收集桶、废液槽。技术流程用户将样品放入样品区的支架上，样品区一次可容纳1飞76份样品(16位X 36条=576份)。用户在软件操作界面点击“扫描”按钮，Tecan扫描元件开始对样品条码进行扫描，扫描完成后软件界面出现和样品排放相对应的示意图，用户可以点击示意图查看样品条码信息、对样品进行分组、选择样品混合方式(单检取样量位960μ 1、6混取样量位160μ1、8混取样量位120 μ I)、选取检测项目等操作。在程序设置界面选取操作程序，操作程序可选择“混样+提取+PCR配液+试剂模板分装”，也可根据用户需要减少中间某个操作 ，由手工代替，增加了实验的灵活性，程序可设置I飞轮，可实现576的I飞倍的样品数量。选取完毕软件根据之前的用户设置计算出本次试验扫需要的试剂、耗材量并提示用户在相应位置加载试剂耗材在耗材区的吸头载架上放置吸头、在中转区设置有载架供放置包括深孔板、PCR板等元件。在试剂区放置实验所需的LH buffer、washbuffer、W/Ebuffer、磁珠、PCR反应液等。试剂耗材加载完毕用户可手动确认或通过仪器扫描确认。点击运行后，仪器开始进行样本混合操作，在样品区吸取一定量的样品(根据混样方式的不同取样体积不同)加入到中转区的96孔深孔板中，样本混合操作根据用户的设置方式在(Tl. 5小时能完成。样品混合完毕，加样器从试剂区吸取960 μ I的LH buffer>500 μ I的Washbuffer、180 μ I W/Ebuffer、180 μ I磁珠、分别加入到中转区的5块96孔深孔板中。机械臂夹取中转区已经加有样本和提取试剂的5块96孔深孔板和带有磁头套管的I块96孔板移动到核酸提取区设置的KingFisher Flex磁珠分离纯化系统的I飞位进行核酸提取，提取在2小时内完成。提取过程涉及在第1、2块96孔板中进行加热裂解、冷却、磁珠吸附核酸等反应，吸附有核酸的磁珠经过第3块板中的Washbuffer、第4块W/E buffer的清洗去掉蛋白、盐类等，在第5块96孔板的W/E buffer中洗脱，释放核酸，这样核酸就被提取纯化出来。在核酸提取的同时，通机械手夹取PCR反应试剂和PCR板移动到中转区，加样器在中转区配制PCR反应液并分装于PCR板中。待核酸提取区操作完毕，机械手夹取装有核酸提取物的第5块96孔板放置于中转区，加样器将核酸分装到有PCR反应液的PCR板中，操作完毕软件图示提醒用户将分装好的PCR板封膜或加盖放到PCR仪中进行检测。同时提示用户移走仪器台面上及废弃物区的垃圾。PCR仪检测结果可导入到仪器的软件中，软件自动生成样品的检测结果。实施例2 采用该全自动核酸提取平台提取中国药品生物制品检定研究院的HBV核酸参考品、HIV核酸参考品，在荧光定量PCR仪上进行检测，检测项目及检测结果如下HBV核酸参考品包括阳性参考品P1-P9，阴性参考品N1-N8，灵敏度参考品LO用阴性血浆稀释至10IU/ml。HIV-1核酸参考品包括阳性参考品P1-P8，阴性参考品N1-N8，灵敏度参考品用阴性血浆稀释至50IU/ml。检测结果HBV阳性参考品P1-P9，符合率9/9 ;阴性参考品N1-N10符合率10/10。说明该平台HBV DNA提取的特异性好。[0064]检测结果检测HIV-1阳性参考品P1-P8，阴性参考品N1-N10符合率8/8。说明该平台HIV-1RNA提取的特异性好。将HBV灵敏度参考品用阴性血浆稀释至10IU/ml，重复检测20次，检出率≥95%，说明该平台对HBV DNA的提取灵敏度好。将HIV灵敏度参考品用阴性血浆稀释至50IU/ml，重复检测20次，检出率≥95%，说明该平台对HIV-1RNA的提取灵敏度好。通过该实例说明，本平台对DNA和RNA均有较好的提取效率，且特异性好。比目前可查到的类似专利“一体化血液核酸筛查平台”(授权公告号CN201695047U)的提取效率优越(类似专利检出率≥95%时HBV DNA灵敏度为20IU/ml，HIV-1RNA灵敏度为100IU/ml)根据本实用新型的公开内容，本领域的技术人员无趣大量实验即可对本实用新型的核酸提取平台得以成功实施。本实用新型公开的实例仅是对本实用新型进行描述，但并不构成对本实用新型的限制。本领域技术人员用相类似的代替物(如相似的液体工作站或相似的核酸提取仪)或改造，或用相关化学和生物学制剂替代本实例描述的内容进行变动，但不超出本实用新型的精神、范围和思想，均落入本实用新型要求保护的范围。
权利要求1.一种通用的自动化核酸提取平台，其特征在于，以液体工作站和核酸提取仪进行组合，该核酸提取平台的基座工作区域设置以下六个功能区 样品区用于放置实验待检样品； 耗材区用于放置实验所需的耗材； 试剂区用于放置实验所需的试剂； 中转区设置有载架，供放置包括但不限于深孔板、PCR板等元件，用于样品加样、试剂添加、PCR反应液配置等操作； 核酸提取区用于放置实现核酸提取所需的核酸提取仪； 废弃物区用于放置实验中所产生的废弃物。
2.权利要求1所述的自动化核酸提取平台，其中所述液体工作站是TecanFREEDOMEV0-2100/150/200Bace系列液体工作站或HAMILTON MICROLAB STAR系列移液工作站。
3.权利要求1或2所述的自动化核酸提取平台，其中所述核酸提取仪是KingFisherFlex磁珠分离纯化系统或MagMAX Express核酸抽提系统磁珠分离纯化系统。
4.权利要求1或2所述的自动化核酸提取平台，其中基座工作区域上方有液体加样臂和机械手，液体加样臂实现液体添加操作，机械手实现标准原件移动操作。
专利摘要本实用新型属于核酸提取领域，具体为一种通用自动化核酸提取平台。该平台是由两个功能设备组成液体工作站和核酸提取仪。液体工作站用于样品、试剂添加，核酸提取仪用于核酸提取，由软件控制，实现核酸提取全自动化。设有6个功能区样品区、耗材区、试剂区、中转区、核酸提取区、废弃物区，其中优选的核酸提取区设有核酸提取装置KingFisher Flex。由软件程序控制完成样品的扫描、试剂样品加入中转区反应池、反应池转入核酸提取区进行核酸提取、PCR反应液配制、加核酸提取物等操作。本平台的核酸提取过程自动化程度高、操作方便，大大提高了核酸提取效率。软件能够与实验室信息化管理系统(LIMS)交互数据，实现实验室管理标准化。
文档编号C12M1/00GK202830011SQ2012204343
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者邹天利, 叶祥忠, 李益民 申请人:北京万泰生物药业股份有限公司