用于测定线粒体功能的方法、组合物和试剂盒的制作方法

用于测定线粒体功能的方法、组合物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本公开内容提供了涉及使用胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)来测量细胞内线粒体活性的方法、组合物、装置和试剂盒。具体地，CDC(例如，产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))用于透化质膜，但不透化细胞内的膜(例如，线粒体膜)。这种选择性透化允许通过测定例如选择性透化之细胞的外部线粒体底物和/或产物的摄入和/或释放来准确评价细胞内线粒体活性。
【专利说明】用于测定线粒体功能的方法、组合物和试剂盒
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119(e)要求在2011年4月8日提交并且标题为“Methods，Compositions and Kits for Assaying Mitochondrial Function”的美国临时专利申请序列号61 / 473，730的优先权，其为了所有目的通过引用整体并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及用于评价细胞内功能以及细胞健康和活力的方法。
[0004]发明背景
[0005]线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)是许多脑肌病(encephalomyopathy)、糖尿病和癌症的核心。构成氧化磷酸化(OxPhos)机制的超过100种基因中的遗传突变与人的线粒体脑肌病有关。由缺陷氧化磷酸化造成的疾病也称为线粒体疾病或线粒体紊乱。它们通常是随年龄逐渐发病的多系统致命疾病。还认为受损的线粒体代谢在糖尿病和癌症的病理生理学中起着关键作用。线粒体(mt)DNA的突变分析表明，线粒体功能障碍是普遍现象，其发生在几乎所有类型的癌症中。发现编码对于氧化磷酸化必不可少之蛋白质的mtDNA中的体细胞突变与几乎所有类型的癌症相关。但是，其功能相关性在大多数情况下还有待确定。
[0006]COSMIC(癌症中体细胞突变目录，Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer)数据库揭示了与氧化磷酸化功能相关的核基因中的突变是常见的。已鉴定了与呼吸复合物I (NADH-泛醌氧化还原酶)结构/功能相关的超过25种核基因中的体细胞突变。此外，细胞代谢由氧化代谢转换为糖酵解(称为代谢重编程(metabolic reprogramming))是癌症表型的标志之一。其原因可以是mtDNA、nDNA中的体细胞突变或者是由宿主和环境因素引起的氧化磷酸化负调节。线粒体功能障碍还涉及其他年龄相关疾病，例如帕金森病和阿尔茨海默病。因此，需要简单且准确的方法来评估病理生理学环境下的线粒体功能。这样的方法可导致确定线粒体代谢与病理生理学之间的“因果”关系，以及治疗性干预(therapeuticintervention)在恢复正常线粒体代谢中的疗效。因此，用于准确测量线粒体功能的方法不但对于检测和理解这些疾病，而且对于评价影响氧化磷酸化之疗法和其他治疗是非常重要的。
[0007] 就细胞生物能学(cellular bioenergetic)而言,其可用于确定线粒体制造ATP的备用(空余(spare))能力(氧化磷酸化能力)及其与呼吸链最大氧消耗(呼吸能力)的关系，这确定了在急性/高ATP需求的条件下细胞的命运。

【发明内容】

[0008]本发明的方面涉及可用于在细胞内条件下准确且可重现地测量线粒体功能的方法、组合物和装置。在一些实施方案中，本发明涉及可用于在不从细胞中分离线粒体的情况下以不同条件准确且可重现地测量线粒体功能的方法、组合物和装置。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素(cholesterol-dependent cytolysin,Q)C)(例如,产气荚膜梭菌溶血素O(perfringolysin O, PFO))用于透化质膜而不透化细胞内的膜(如线粒体膜)。这种选择性透化允许通过测定例如可在选择性透化细胞的外部测量的线粒体底物和/或产物的摄入和/或释放来准确评价细胞内线粒体活性。
[0009]与涉及将线粒体从细胞中移除的方法不同，用经透化的细胞进行分析提供线粒体生物或生理状态的更准确的评估，同时允许直接与包含和经透化细胞中相同线粒体量的全细胞相关联。通常，用于分析细胞内线粒体活性的方法包括使用损害细胞膜和线粒体膜之一或损害两者的去污剂(detergent)或其他透化剂。去污剂通常例如使线粒体膜溶解，并且即使通过低于< 0.01%的小心滴定也难以建立维持线粒体功能的去污剂浓度。
[0010]基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的方法提供了细胞膜的有效透化而不破坏线粒体膜。因此，用细胞溶素透化避免了线粒体分子向细胞内和周围细胞环境中的不期望的释放。这也避免了胞浆分子进入线粒体并干扰线粒体功能。而且，胆固醇依赖性细胞溶素在创造适合于在细胞中测量线粒体活性的条件方面出乎意料地有效。在一些实施方案中，在多至50nM或在一些情况下更多(例如，0.1至20nM)的宽动态范围中的浓度下，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的方法提供了细胞膜的有效透化而不破坏线粒体膜。另外，由于细胞溶素是蛋白质，所以通常可以不同稀释度非常准确地掌控它们。
[0011]因此，基于胆固醇依赖性细胞溶素的透化技术可用于评价一种或更多种线粒体活性而不破坏细胞环境，原因是当线粒体膜暴露于如本文所述的胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)时，其大部分保持完整。可测定底物摄入和/或产物释放以评价一种或更多种线粒体特异性功能(例如，氧化磷酸化)。因此，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的测定结果可提供天然细胞环境下线粒体活性的准确评价。在一些实施方案中，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的测定结果可提供从疑似患有线粒体疾病之对象得到的细胞中线粒体活性的准确评价。
[0012]在一些实施方案中，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的细胞透化允许分析外源性试剂(例如，不渗透穿过质膜的分子)对一种或更多种细胞内功能的作用。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)有助于使用外源性试剂(例如，染料、荧光蛋白、标志物或其他试剂)来探测一种或更多种细胞内功能。例如，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)可有助于使用外源性试剂例如离子敏感性染料(例如，钙敏感染料、pH敏感染料等)或离子敏感性荧光蛋白来探测一种或更多种细胞内功能。在一些实施方案中，可使用基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)以有助于用外源性核酸(例如，表达载体)转染细胞。
[0013]在一些实施方案中，提供了基于用产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)选择性透化质膜的方法，所述PFO是来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的胆固醇依赖性成孔蛋白(pore forming protein)。在一些实施方案中，因为与细胞内的膜相比质膜中浓缩了相对大量的胆固醇，所以细胞内膜仍在很大程度上不受CDC(例如，PF0)影响。在一些实施方案中，与常规的细胞透化技术(例如，采用洋地黄皂苷的那些技术)相比，PFO透化细胞保持了线粒体完整性，并且在宽范围的细胞类型和缓冲液条件中产生了可重现的结果。
[0014]在一些实施方案中，提供了利用基于PFO的细胞透化(例如，以微板形式)的方法，所述方法可用于测定`空余氧化磷酸化(OxPhos)能力和线粒体生物能学的其他特性。在一些实施方案中，所述方法允许在不从细胞中分离线粒体的情况下评估线粒体功能。在一些实施方案中，所述方法可用于测定α)空余氧化磷酸化能力和总氧化磷酸化能力，(ii)空余呼吸能力和总呼吸能力，(iii)电子传递/呼吸链(electron transport /respiratory chain, ETC / RC)能力的特异性缺陷，(iv)TCA循环功能和/或(V)线粒体代谢的细胞特异性特性。在一些实施方案中，基于PFO的测定可用于在单次测定中测量空余氧化磷酸化能力(SOC)和空余呼吸(ETC / RC)能力(SRC)。在一些实施方案中，评价空余氧化磷酸化能力或总氧化磷酸化能力包括将充足量的ADP (例如,对于细胞为ImM,对于成肌细胞≥2mM)和Pi (例如，≥IOmM)与期望底物一起用于呼吸介质中。在一些实施方案中，所述方法可用于测定空余氧化磷酸化能力和其他生物能学特性而不需要从细胞中分离线粒体。在一些实施方案中，方法可用于测定:(i)线粒体代谢的细胞特异性特性，(ii)药物对ETC / RC功能和其他线粒体功能的直接和/或间接作用，(iii)缺陷型氧化磷酸化复合物，(iv)化合物的解偶联活性和/或(V)可损害线粒体功能完整性的条件。
[0015]在一些实施方案中，本文所公开的方法可用于评估细胞系、原代细胞和组织中的线粒体功能和代谢。在一些实施方案中，所述方法可用于测定氧化磷酸化能力和呼吸链能力。在一些实施方案中，所述方法可用于测定单独的呼吸氧化磷酸化复合物(1-V)的能力。在一些实施方案中，所述方法可用于评价线粒体通透性转换。在一些实施方案中，所述方法可用于诊断受损的线粒体代谢(例如，由于基因突变或药物毒性)。在一些实施方案中，所述方法可用于在维持线粒体功能的条件下评价细胞器(例如，线粒体、溶酶体、细胞核、内质网等)功能。在一些实施方案中，所述方法可用于通过评估基于PFO的透化之后内膜蛋白质的蛋白酶敏感性来评价内膜的蛋白质拓扑学。在一些实施方案中，所述方法可用于使用条件性孔形成(conditional pore-formation)来促进大分子递送至细胞内。
[0016]在一些实施方案中，PFO透化细胞用于测定对于在单个添加时不同NADH底物(例如，丙酮酸/丙酮酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸盐和谷氨酸/谷氨酸盐)具有最大呼吸响应的条件。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于使用适用于临床研究之小样品来评估线粒体功能。在一些实施方案中，所述方法可用于在不破坏线粒体功能的条件下评估线粒体通透性转换和其他细胞过程以及细胞器。
[0017]在一些实施方案中，提供了可以对线粒体功能测定使用低至0.1nM之浓度的PFO衍生物。在一些实施方案中，提供了可在DTT或其他还原剂不存在的情况下使用的PFO衍生物。在这样的实施方案中，避免了由DTT或其他还原剂造成的O2消耗。在一些实施方案中，使用最小量的DTT(例如，≤IOOnM DTT)。在一些实施方案中，提供了适用于不同细胞(例如，β细胞、成纤维细胞、神经元细胞、原代成肌细胞/管、乳腺上皮细胞、胚胎成纤维细胞、巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞)和不同物种(例如，小鼠、大鼠、仓鼠和人)的细胞的基于PFO的测定。在一些实施方案中，提供了 PFO的不同变体(参见，例如，表3和5)。
[0018]根据本发明的一些方面，提供了这样的方法，其包括使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触，并且测量细胞的细胞内功能。在一些实施方案中，细胞内功能是细胞的代谢速率、细胞的呼吸速率、有氧呼吸与无氧呼吸之比、分子的消耗速率或分子的产生速率。在一些实施方案中，细胞内功能指示细胞健康或细胞生存力。在一些实施方案中，细胞内功能是线粒体功能。在一些实施方案中，所述方法用作凋亡(细胞死亡机制)测定。
[0019]应理解，制备物通常包含多种细胞。这样的制备物可包含任意类型的一种或更多种细胞。在一些实施方案中，细胞可以是动物细胞或植物细胞。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞从个体获得。细胞可以是任何的哺乳动物细胞。细胞可以是任何的人细胞。细胞可选自:淋巴细胞、B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞、髓样细胞(myeloid cell)、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多叶核嗜中性粒细胞(hypersegmented neutrophil)、单核细胞、巨噬细胞、网状细胞(reticulocyte)、血小板、肥大细胞、凝血细胞、巨核细胞、树突细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞(parafollicular cell)、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、松果体细胞(pineal cell)、松果体细胞(pinealocyte)、胶质细胞(glial cell)、成胶质细胞、星形细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞(magnocellular neurosecretory cell)、星状细胞(stellatecell)、伯特歇尔细胞(boettcher cell);垂体细胞、促性腺细胞(gonadotrope)、促皮质激素细胞(corticotrope)、促甲状腺细胞(thyrotrope)、促生长激素细胞(somatotrope)、催乳激素细胞(Iactotroph)、肺细胞、I型肺细胞、II型肺细胞、克拉拉细胞(Clara cell)；杯状细胞、肺泡巨噬细胞、心肌细胞、周皮细胞(pericyte)、胃细胞、胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、帕内特细胞(paneth cell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝细胞(liver cell)、肝细胞(h印atocyte)、枯氏细胞(Kupffer cell)、骨细胞(bone cell)、成骨细胞、骨细胞(osteocyte)、破骨细胞、成牙质细胞、成牙骨质细胞、造釉细胞、软骨细胞(cartilage cell)、成软骨细胞、软骨细胞(chondrocyte)、皮肤细胞、毛发细胞、丝胞(trichocyte)、角质细胞、黑色素细胞、疲细胞、肌肉细胞(muscle cell)、肌细胞(myocyte)、成肌细胞、肌管、脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞(tendon cell)、足细胞、球旁细胞(juxtaglomerular cell)、球内系膜细胞(intraglomerular mesangial cell)、球外系膜细胞、肾脏细胞、肾脏细胞、致密斑细胞(macula densa cell)、精细胞、塞尔托利细胞(sertoli cell)、莱氏细胞(leydig cell)、卵母细胞及其混合物。因此，细胞可以是间叶细胞、外胚层和内胚层来源的细胞。细胞可选自脐带血细胞、干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、祖细胞、诱导性祖细胞(inducedprogenitor cell)、自体细胞(autologous cell)、同种移植细胞、同种异体移植细胞、异种移植细胞和遗传工程细 胞。
[0020]根据本发明的一些方面，提供了这样的方法，其包括使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)相接触以及测定制备物中分子的水平，其中所述分子的水平指示细胞的细胞内功能。在一些实施方案中，分子的水平指示线粒体功能。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是选自表1的蛋白质或者其变体或衍生物。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是具有对应于表1所列GenBank登录号的氨基酸序列的蛋白质或者其变体或衍生物。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是表1所列胆固醇依赖性细胞溶素家族中成员的蛋白质或者其变体或衍生物。
[0021]在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。本文使用的术语“产气荚膜梭菌溶血素O(PFO) ”指产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)细菌的能够在胞浆膜中形成孔的细胞溶素或该细胞溶素的变体、衍生物或重组形式。在一些实施方案中，PFO以胆固醇依赖方式在胞浆膜中形成孔。在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其变体或衍生物。在一些实施方案中，PFO包含是如SEQ ID NO:1至12中任一所示氨基酸序列之片段的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述片段包含如SEQ ID NO:1至7中任一种所述并且不包含N端信号序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，N端信号序列是所示氨基酸序列的前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35 个氨基酸。在一些实施方案中，PFO包含与如SEQ ID NO:1至12中任一所示序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更高的序列同一性或序列同源性的氨基酸序列。序列同源性可使用NCBI (Bethesda,Maryland)开发的多种公开可得的软件工具(例如，可通过网络得到)来计算。示例性工具包括可在blast, ncb1.nlm.nih.gov / Blast, cgi上在线得到的“protein blast”,其可以以其默认设置使用。在一些实施方案中，PFO包含与如SEQ ID NO:1至12中任一所示序列相比在多至25个、多至20个、多至15个、多至10个、多至5个或多至2个位置处具有氨基酸替换的氨基酸序列。
[0022]在一些实施方案中，PFO包含具有一个或更多个保守氨基酸替换(例如与SEQ IDNO:1至12中任一个相比的一个或更多个保守氨基酸替换)的氨基酸序列。本文使用的“保守氨基酸替换”指不改变其中进行氨基酸替换之蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸替换。可根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体。氨基酸的保守替换包括对以下组中氨基酸进行的替换:(a)M、1、L、V ； (b)F、Y、W ； (c)K、R、H ； (d)A、G ； (e)
S、T;(f)Q、N和(g)E、D。因此，保守氨基酸替换可提供蛋白质的功能等价的变体或同源物。
[0023]在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。在所述方法的一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列 ，其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换。在这样的实施方案中，利用PFO的方法还可包括将还原剂添加到制备物中。在某些实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
[0024]在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸459位半胱氨酸至丙氨酸的替换以及一个或更多个其他氨基酸替换。在所述方法的一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换以及一个或更多个其他氨基酸替换。
[0025]在一些实施方案中，提供了这样的分离的产气荚膜梭菌溶血素O (PFO)，其包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其在434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸。在一些实施方案中，提供了这样的分离的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)，其包含如SEQ ID N0:1或2所示的氨基酸序列，其在434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸以及具有一个或更多个其他氨基酸替换。
[0026]在涉及测定制备物中分子水平的方法的一些实施方案中，所述分子是02。在一些实施方案中，制备物中O2的水平指示细胞耗氧率。在一些实施方案中，所述耗氧率指示线粒体功能。在涉及测定制备物中分子水平的方法的一些实施方案中，所述分子是H+。在一些实施方案中，制备物中H+的水平指示细胞的H+产生速率。
[0027]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与细胞呼吸效应物(cellular-respiration effector)相接触。在一些实施方案中，细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体(protonphore)。在一些实施方案中，核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在这样的实施方案中，所述方法还可包括测量细胞的耗氧率，其中ADP刺激的耗氧率指示细胞中的氧化磷酸化。在一些实施方案中，质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP)。在这样的实施方案中，所述方法还可包括测量细胞的耗氧率，其中FCCP刺激的耗氧率指示细胞中电子传递和呼吸链功能。
[0028]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸盐或其组合相接触。在这样的实施方案中，所述方法的结果可以指示细胞中复合物I(NADH-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
[0029]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐相接触。在这样的实施方案中，所述方法的结果可以指示细胞中复合物II (琥珀酸/琥珀酸盐-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
[0030]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与甘油-3-磷酸相接触。在这样的实施方案中，所述方法的结果可以指示细胞中复合物III (泛醇-细胞色素C氧化还原酶)的酶活性。
[0031]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与N，N, N'，N'-四甲基对苯二胺(TMPD)和/或抗坏血酸/抗坏血酸盐相接触。在这样的实施方案中，所述方法的结果可以指示细胞中复合物IV(细胞色素c氧化酶)的酶活性。
[0032]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐和ADP相接触和/或使细胞与甘油-3-磷酸相接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐、甘油-3-磷酸和ADP相接触。在这样的实施方案中，所述方法的结果可以指示细胞中复合物V (ATP合酶)的酶活性。
[0033]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂(transport inhibitor)、离子载体(ionophore)或krebs循环(krebs cycle)抑制剂相接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与鱼藤酮(rotenone)、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN和寡霉素相接触。
[0034]在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与测试剂(test agent)相接触并测定测试剂对细胞内功能(例如，线粒体功能)的作用。在一些实施方案中，测试剂是候选药物。因此，在一些实施方案中，所述方法提供了用于药物筛选的测定。所述方法在一些实施方案中可用于筛选未知或已知化合物(例如，已知的生物活性化合物)的文库，从而鉴定影响细胞内功能(例如，解偶联ATP合成与呼吸链功能)的化合物。在另一些实施方案中，所述方法可用于评价化合物的毒性。因此，在一些实施方案中，所述方法可用于评价先导化合物。
[0035]在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定细胞中的一个或更多个基因突变。在一些实施方案中，所述方法的结果指示一个或更多个基因突变是否影响细胞的细胞内功能(例如，线粒体功能)。在一些实施方案中，一个或更多个基因突变与线粒体疾病有关。
[0036]在一些实施方案中，提供了这样的方法，其包括使包含从对象获得的细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触；以及测定制备物中分子的水平，其中分子的水平指示细胞中呼吸链缺陷存在或不存在。
[0037]在一些实施方案中，细胞从患有或疑似患有线粒体疾病的个体获得。在一些实施方案中，所述方法的结果有助于诊断个体患有一种或更多种线粒体疾病。在一些实施方案中，线粒体疾病选自:肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(Myoclonic Epilepsy withRagged Red Fiber, MERRF);线粒体肌病、脑病、高乳酸血症和卒中(Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactacidosis, and Stroke, ME LAS);糖尿病和耳聋(Diabetesmellitus and deafness, DAD)组合，其在早年可由于线粒体疾病；母体遗传糖尿病和耳聋(Maternally Inherited Diabetes and Deafness, MIDD)、莱伯遗传性视神经病(Leber ' s Hereditary Optic Neuropathy, LHON);慢性进行性眼外肌麻痹(chronicprogressive external ophthalmoplegia, CPEO);利氏病(Leigh Disease)；卡恩斯-赛尔综合症(Kearns-Sayre Syndrome, KSS);弗里德赖希共济失调(Friedreich, sAtaxia, FRDA);辅酶QIO(Co-QIO)缺陷；神经病、共济失调、色素性视网膜炎及上睑下垂(Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis, NARP);肌神经源性胃肠性脑病(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy,MNGIE);复合物 I 缺陷；复合物 II 缺陷；复合物III缺陷；复合物IV缺陷；复合物V缺陷；其他线粒体疾病和影响线粒体功能的其他肌病(myopathy)。在一些实施方案中，线粒体疾病从父母遗传到孩子(即，遗传病)。
[0038]在一些实施方案中，具有线粒体疾病的一种或更多种症状的个体可被怀疑患有线粒体疾病。线粒体疾病的症状包括肌无力或运动不耐(exercise intolerance)、心力衰竭或节律紊乱、痴呆、运动障碍、卒中样发作、耳聋、失明、眼皮下垂、眼运动性受限、呕吐和癫痫。在身体活动期间，肌肉可变得容易疲劳或无力。可发生肌肉痉挛。恶心、头痛和呼吸困难也与这些疾病有关。通常，线粒体疾病在年轻时发生或首次表现(例如，在儿童期时，20岁之前)。因此，在一些实施方案中，所述方法可用于诊断或有助于诊断儿童个体中的线粒体疾病。但是，应理解本文所公开的诊断方法可用于任意年龄的个体。[0039]“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠(murine)、猿(simian)、人、家畜(farm animal)、运动动物(sport animal)和宠物。在一些实施方案中，对象、个体或患者是儿童。在一些实施方案中，对象、个体或患者是幼儿。在一些实施方案中，对象、个体或患者是婴儿。如本文所定义的，本文使用的术语“ JL童”意指超过3岁且在青春期之前的人。本文使用的术语“幼儿”意指年龄大于12个月至三岁的人。本文使用的术语“婴儿”意指年龄不大于12个月的人。在一些实施方案中，对象、个体或患者处于青春期或在青春期以后。
[0040]在一些实施方案中，提供了用外源性核酸转染细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与本文公开的胆固醇依赖性细胞溶素中的任意一种或更多种相接触；以及使细胞与外源性核酸(例如，表达载体、克隆载体等)相接触。在一些实施方案中，所述方法可用于转染难以用常规转染试剂(例如，基于脂质体的试剂)转染的细胞。在一些实施方案中，所述方法可用于转染在悬液中生长的细胞，例如，造血细胞。在一些实施方案中，所述方法可用于转染干细胞或原代细胞。
[0041]在所述方法的一些实施方案中，制备物被包含在容器(例如，孔)中。在一些实施方案中，容器是多孔板中的孔。因此，在一些实施方案中，所述方法可以以多重形式(例如，高通量形式)进行。在一些实施方案中，所述方法使用多孔细胞外通量分析仪实施。
[0042]根据本发明的一些方面，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器和容纳有用于评价细胞之细胞内功能的试剂的容器。在一些实施方案中，细胞内功能是线粒体功能。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器和容纳有细胞呼吸效应物的容器。[0043]在所述试剂盒的一些实施方案中，细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。在某些实施方案中，核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中，质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
[0044]在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/ α-酮戊二酸盐或其组合的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有琥珀酸/琥珀酸盐的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有甘油-3-磷酸的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有Ν，Ν，Ν'，Ν'-四甲基对苯二胺(TMPD)的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有抗坏血酸/抗坏血酸盐的容器。
[0045]在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有测定缓冲液的容器。
[0046]在所述试剂盒的一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素选自表1或者其变体或衍生物。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其变体或衍生物。在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。在一些实施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换。在一些实施方案中，提供了这样的试剂盒，其包含容纳有还原剂的容器。在一些实施方案中，还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
[0047]在所述试剂盒的一些实施方案中，至少一个容器是可重复使用的容器。在所述试剂盒的一些实施方案中，至少一个容器是单次使用的容器。在所述试剂盒的一些实施方案中，至少一个容器是管或瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中，管是按扣盖(snap-top)管或螺旋盖(screw-top)管。在所述试`剂盒的一些实施方案中，瓶是按扣盖瓶或螺旋盖瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中，至少一个容器是玻璃小瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中，容器一起被容纳在盒子或包装中。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于使细胞透化的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于在特定温度(例如，小于(TC、室温)下储存至少一个容器的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于使用试剂盒中提供之试剂实施本文所公开的方法中之任一种的说明书。
[0048]虽然在一些实施方案中，本文所公开的试剂盒可用于研究目的，但是在另一些实施方案中，本文所公开的试剂盒可用于诊断目的。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含可用于诊断或有助于诊断个体患有线粒体疾病(例如，包括本文所公开的线粒体疾病中的任一种)的方法的一种或更多种试剂或组分。
【专利附图】

【附图说明】
[0049]图1提供了典型哺乳动物细胞中葡萄糖代谢的非限制性概览。示出了糖酵解、TCA循环与氧化磷酸化系统的关系。示出了产生并氧化NADH和FADH2的反应。CC:细胞色素c ;Q:泛醌；C1-V:氧化磷酸化复合物I至V ;MAS:苹果酸-天冬氨酸穿梭；GPS:甘油-3-磷酸穿梭。期望细胞周边环境中乳酸、O2和CO2水平的测量给出糖酵解、呼吸和TCA循环的速率。
[0050]图2阐明了基于洋地黄皂苷(DIG)的细胞透化。使用XF分析仪在包含琥珀酸作为底物的不含Ca2+的缓冲液中测量INSlE的呼吸。测量基础呼吸速率之后，用DIG(第一个箭头)、然后用ADP透化细胞，添加或不添加细胞色素c (CC)(第二个箭头)。对于组DIG、DIG+ADP和DIG+ADP+CC，第二次添加的分别是缓冲液、ADP和ADP+CC。
[0051]图3阐明了与洋地黄皂苷性能相比的PFO性能。图3A示出了原代胰岛β细胞。图3Β示出了中国仓鼠肺成纤维细胞。如下进行注射:“a”是在作为呼吸底物的琥珀酸存在下的具有nPF0(25nM)或洋地黄皂苷(DIG，图3A中为0.010%，图3B中为0.005% )的ImM八0卩+1(^]?细胞色素(3(〇7七C或CC) ;“b”是Iyg / ml寡霉素。OCR速率以绝对值(图3A)示出或相对于第三速率归一化(图3B)。
[0052]图4示出了基于PFO的测定不需要外源性细胞色素C。示出了由琥珀酸支持的ADP刺激的INSlE细胞呼吸。如下进行注射:“a”是nPFO，“b”是具有或不具有细胞色素c的ADP。
[0053]图5阐明了氧化磷酸化能力和呼吸(ETC/RC)能力。ADP和FCCP刺激的呼吸分别提供氧化磷酸化能力和呼吸能力。图5A示出了中国仓鼠肺成纤维细胞V79-G3中ADP和FCCP刺激的呼吸的相对水平。如下进行注射:“a”是ImM ADP ;“b”是2 μ M FCCP。图5B示出了与完整细胞中基础呼吸的敏感性相比，经透化的V79-G3细胞中ADP刺激的呼吸的寡霉素敏感性(偶联测试)。如下进行注射:“a”是ImM ADP或ADP+nPFO ;“b”是2 μ g / ml寡霉素。图5C示出了 nPFO透化后的呼吸衰退，其是因为由胞浆稀释造成的ADP限制。如下进行注射:“a”是 5nM nPFO ;“b”是缓冲液(nPFO)或 ImM ADP (nPFO+ADP)或 ImM ADP+104M细胞色素 c (nPF0+ADP+CC)。
[0054]图6示出了大鼠胰`岛β细胞中ADP刺激的和FCCP刺激的呼吸的比较水平。图6Α示出了大鼠胰岛瘤INSlE细胞。如下进行注射:“a”是nPFO+ADP ;“b”是FCCP。图6B示出原代大鼠β /胰岛细胞。如下进行注射:“a”是nPF0;“b”是琥珀酸+ADP;“c”是FCCP。原代细胞中基础呼吸的较低速率是因为在注射之前(箭头“b”)进行了预饥饿并且不存在任何外源性底物。
[0055]图7示出了使用基于PFO之方法的用于复合物I缺陷的功能性测定。图7A示出了对复合物I底物显示出呼吸缺乏的复合物I突变体的结果。图7B示出了对复合物I底物显示出恢复呼吸的补充对照细胞。图7C示出了来自B组的将箭头“a”之前之基础速率设定为“O”的数据。如下进行注射:“a”是nPF0，“b”是琥珀酸(Suc)或谷氨酸+苹果酸(Glu+Mal)。
[0056]图8阐明了寡霉素处理后底物供应至β细胞ETC/RC中的限制以及对Ca2+介导之线粒体通透性转换的敏感性。用寡霉素(2yg / ml)处理所有的组，然后在>60分钟之后，在存在或不存在nPFO的情况下用琥珀酸和/或FCCP处理。组如下。“寡霉素_缓冲液”指示仅用寡霉素处理；“寡霉素—SF”指示仅寡霉素+琥珀酸+FCCP ;“寡霉素_--”指示寡霉素+nPFO+FCCP处理，稍后添加琥珀酸；“寡霉素_PSF”指示寡霉素+nPFO+琥珀酸+FCCP ；“寡霉素_PSFCa”指示在添加nPFO+琥珀酸+FCCP之后添加寡霉素和1.3mM CaCl2。
[0057]图9提供了 PFO纯化方案的概览。[0058]图10提供了运作模型的略图，所述运作模型示出β细胞呼吸在细胞完整时主要由氧化还原穿梭来支持。如果β细胞主要由氧化还原穿梭支持，则当使其透化时，复合物I依赖性呼吸应显著降低。
[0059]图11示出了 β细胞表现出低水平的复合物I依赖性呼吸。图1lA是与对照(Con)相比，通过分别用增加浓度的鱼藤酮(Rot)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)、抗霉素A (Ant A)测量呼吸抑制来确定复合物1、II & III依赖性呼吸。图1lB示出了 INSlE细胞中鱼藤酮、TTFA和抗霉素A的最大呼吸抑制百分比。
[0060]图12示出了经透化的β细胞不表现出复合物I依赖性呼吸:图12Α示出来自原代β细胞的结果。图12Β示出来自原代星形细胞的结果。图12C示出来自CCL16肺成纤维细胞的结果。图12D示出了在谷氨酸+苹果酸和鱼藤酮存在下分离的线粒体中的NAD(P)H水平。箭头指示以下内容:“a”指示细胞透化；“b”指示底物+ADP(对于图12A、12B)或ADP(对于图12C)。在图12C中，在透化之前在呼吸缓冲液中添加所有底物。丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、异柠檬酸、α -酮戊二酸和鱼藤酮分别用单字母符号P、G、Μ、1、K和R指示。
[0061]图13示出了 β细胞的相对呼吸(ETC/RC)和氧化磷酸化(OxPhos)能力在细胞类型之间是相当的。图13A示出了 INSlE细胞。图13B示出了 V79中国仓鼠肺成纤维细胞。图13C示出了原代β细胞。箭头指示以下内容:“a”指示用ADP(对于图13A、13B)或不用ADP (对于图13C)进行透化；“b”指示FCCP (对于图13AU3B)或ADP (对于图13C) ;“c”指示FCCP。用ADP和FCCP的最大呼吸刺激分别被当作氧化磷酸化能力和呼吸能力的指标。
[0062]图14示出了当抑制氧化磷酸化时β细胞呼吸逐渐衰退。测试了相对于呼吸链功能障碍的底物限制。图14Α示出了葡萄糖(Glu)和丙酮酸(Pyr)刺激INSlE细胞中的呼吸，其在寡霉素存在下逐渐衰退。Lo & Hi指示2mM和16.7mM葡萄糖。图14B示出了寡霉素存在下的呼吸衰退是因为底物供应至呼吸链受限。字母P、S、F分别指示透化、琥珀酸和FCCP。
[0063]图15示出了糖酵解、TCA循环与氧化磷酸化之间的内在关系。重点是如所指示地产生电子供体(例如NADH和FADH2)以支持氧化磷酸化的反应。虚线示出了产生NADH和FADH2的反应，而实线示出了消耗它们的那些反应。在两端具有箭头的线示出了可逆反应。F-l, 6-BP:果糖-1，6- 二磷酸；G-3-P:甘油醛_3_磷酸；GPS:甘油-3-磷酸穿梭;MAS:苹果酸天冬氨酸穿梭；C1-V:氧化磷酸化复合物Ι-ν ；p:质子动力；线粒体膜电位；pH:跨越线粒体内膜的PH差；P1:无机磷酸-磷酸盐:Q:泛醌。
[0064] 图16示出了用洋地黄皂苷透化细胞测定线粒体功能的结果。β细胞如实施例8所述生长。在2mM(图16Α至16C)或15mM葡萄糖(图16D至16F)存在下使用包含IOmM琥珀酸的不含Ca2+的LKB缓冲液。图16A示出了对于最大呼吸的外源性Cyt C。β细胞首先用0.01%洋地黄皂苷(DIG)透化，然后单独添加ImM ADP (ADP)或将其与10 μ M CytC (ADP+CC) 一起添加(右边箭头)。对照组不接受ADP或Cyt C。图16B示出了在图16A中使用的测定条件下与ATP合成偶联的呼吸。细胞首先在2 μ g / ml寡霉素存在(寡霉素-FCCP)或不存在(对照，寡霉素，FCCP)下用0.01 % DIG透化，然后进行以下添加:“对照”，是ADP+CC ;“寡霉素”，是对照加寡霉素；“FCCP”，是对照加2 μ M FCCP 寡霉素-FCCP”，是寡霉素加2μΜ FCCP。图16C示出了来自图16B并且将基础速率设定为100%用以比较ADP和FCCP刺激之呼吸速率的数据。图16D至16F示出了来自原代大鼠星形细胞(图16D)、仓鼠B2-MWFE细胞(图16E)和人H1080细胞(图16F)的结果，所述细胞首先用指定浓度的洋地黄皂苷(DIG)透化，然后添加ImM ADP和10 μ M Cyt C (ADP+CC)。
[0065]图17示出了用nPFO透化细胞测定线粒体功能的结果。如实施例8所述制备细胞，并在包含2mM葡萄糖(图17A至17D)或15mM葡萄糖(图17E至17F)的不含Ca2+的LKB缓冲液中进行测定。相对于基础呼吸速率(basal respiration rate,BRR)的ADP和FCCP刺激的呼吸分别指示空余氧化磷酸化能力(Spare OxPhos capacity, S0C)和空余呼吸能力(spare respiratory capacity, SRC)。图 17A 不出了用 25nM nPFO 或 0.01 % 洋地黄阜苷(DIG)透化的原代胰岛β细胞的呼吸响应。在10 μ M Cyt C存在下在透化时添加琥珀酸和ADP(Succ+ADP)。添加I μ g / ml寡霉素(寡霉素)以测定偶联效率。图17B示出了使用INSlE细胞进行nPFO滴定的结果。测定条件除不添加Cyt C之外与图17A相同。添加ADP以及不同浓度的nPFO(OADP)和2μΜ FCCP(OFCCP)。图17C示出了 INSlE细胞中与SRC相比的S0C。图17D示出了 INSlE细胞中与SOC相比的nPFO浓度。图17E示出了 V79-G3细胞中与SRC相比的S0C。图17F示出了 V79-G3细胞中与SOC和SRC相比的nPFO浓度。
[0066]图18A至18H示出了在nPFO透化细胞中线粒体完整性和呼吸偶联的评估。在如实施例8所述使细胞生长之后，在包含具有2mM葡萄糖(图18A至18C)或15mM葡萄糖(图18D至18H)的IOmM琥珀酸的不合Ca2+的LKB缓冲液中测量呼吸。β细胞首先用至少InM nPFO透化，然后在添加指定化合物之后测量呼吸速率的变化。图18A示出了 nPFO透化INSlE细胞中的线粒体完整性(“ADP”指示单独的ImM ADP ;“ADP+CC”指示ImM ADP+10 μ MCyt C)。图18Β示出了 nPFO透化INSlE细胞中的呼吸偶联(“ADP”指示单独的ImM ADP ；“寡霉素”指示ImMADP和I μ g / ml寡霉素；“ADP+FCCP”指示ImM ADP+1 μ g / ml寡霉素+2 μ M FCCP)。图18C示出了来自图18B的用设定为100%的基础速率归一化以比较ADP和FCCP刺激的呼吸速率的数据。图18D示出了 nPFO透化V79-G3细胞的完整性(“对照“指示仅缓冲液；“ADP” 指示 ImM ADP ;“ADP+CC” 指示 ImM ADP 和 10 μ M Cyt C)。图 18Ε 示出了与寡霉素处理的完整(寡霉素)V79-G3细胞相比，nPFO透化(nPFO) V79-G3细胞中的呼吸衰退。图18F示出了与经透化的V79-G3细胞相比，完整V79-G3细胞中的寡霉素不敏感性呼吸(“寡霉素”指示ImM ADP后添加寡霉素；“nPF0+ADP_寡霉素”指示nPFO和ImM ADP后添加寡霉素)。图18G和18H分别示出了 nPFO透化HEK293和SHSY-5Y细胞中的线粒体完整性(“ADP” 指示 ImM ADP ;“ADP+CC” 指示 ImM ADP+10 μ M Cyt C)。
[0067]图19Α至19F示出了氧化磷酸化和ETC/RC的空余(备用)能力和总能力的估计。如实施例8所示使β细胞生长，并且在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB (图19A和图19D至19F)或LPBT (图19B和19C)缓冲液中测量测定。与ImM ADP 一起添加IOmM琥珀酸以测量空余氧化磷酸化能力(SOC)。在测量ADP刺激的呼吸之后，添加FCCP以测量空余ETC / RC能力(SRC)。在图19A至19C中，与nPFO—起添加琥珀酸和ADP，而在图19D至19F中，在用nPFO透化之后添加它们。图19A示出了完整(SRCi)和透化(SRCp) HEK293细胞中的SOC和SRC。在“对照”中，向未透化细胞添加2 μ M FCCP ;在“1^?0”中，在测量经琥珀酸+ADP刺激的呼吸之后向透化细胞中添加3μ M FCCP。图19B示出了通过将SOC添加到基础呼吸速率的寡霉素敏感性部分中来估计HEK293细胞中的总氧化磷酸化(TOC)能力。总呼吸能力通过nPFO透化细胞中的最大呼吸速率来估计(“PSA_F”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加FCCP) ;“0_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。图19C示出了通过监测ADP刺激的呼吸中寡霉素敏感部分来测定HEK293细胞的偶联效率(“PSA_0”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加寡霉素；“0_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。图19D至19F示出了用于在不同细胞中通过系列添加nPFO、ADP和FCCP确定TOC的策略，所述不同细胞例如HEK293 (图19D)、SHSY_5Y(图19E)和β细胞(图19F)。
[0068]图20Α至201示出了不同因素对氧化磷酸化能力的作用。实验条件如实施例8所述并参照图19。与nPF0(图20A、20B、20C、20G、20H)同时或在其之后(图20E、20F)添加呼吸底物(每个IOmM)和ADP(ImM)。图20A描绘了在包含2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB缓冲液中原代β细胞氧化磷酸化能力的底物依赖性改变(“succ”指示琥珀酸；“G+M”指示谷氨酸+苹果酸；“G3-P”指示甘油-3-磷酸)。图20B示出了在与图20A相关的实验中使用的测定条件下，β细胞中不含Ca2+对由琥珀酸支持的氧化磷酸化的作用(“对照”指示琥珀酸+ADP CaCl2”指示与琥珀酸+ADP —起添加700 μ M CaCl2)。图20C示出了不同呼吸缓冲液对ΗΕΚ293细胞之氧化磷酸化能力的作用。在不同缓冲液(参见表6)中孵育细胞，然后测量ADP刺激的呼吸。添加2yg / ml寡霉素以测试偶联效率。图20D示出了不同缓冲液中的偶联效率(CE)。对来自图20C的数据绘图。图20E示出了磷酸盐(KH2P04)对氧化磷酸化能力和呼吸能力的作用。对于LKB、HKB和MAS缓冲液参见表6。KH2PO4是用IOmM KH2PO4代替0.4mM KH2PO4的LKB。图20F示出了来自图20E的将基础呼吸速率设定为100%之后重新绘图的数据。图20G示出了对于INSlE细胞的不同缓冲液中的空余氧化磷酸化能力，将LKB与LPBT进行比较，将HKB与HPBT进行比较。透化之前的基础呼吸速率设定为100%。图20H示出了在高Na+和高K+缓冲液中INSlE细胞的基础呼吸速率和ADP刺激的呼吸速率的差异。示出了对于图20G的LPBT和HPBT缓冲液中的实际呼吸速率。图201示出了 INSlE细胞中不同缓冲液对复合物I和复合物II依赖性呼吸的作用。
[0069]图21A至21F示出了关于线粒体功能障碍和线粒体代谢具体特征的数据。在图21A至21C中，示出了依赖于由谷氨酸+苹果酸(Glu+Mal)支持的呼吸的复合物I。在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+ 的LKB缓冲液中进行测定。用InM nPFO透化β细胞并使用指定底物测量ADP刺激的呼吸。在图21Α中，示出了由Glu+Mal支持的呼吸的鱼藤酮敏感性测试。使用2 μ M鱼藤酮(Rot)抑制复合物I。在图21Β中，示出了复合物I缺陷型CCL16-B2细胞中由Glu+Mal支持的呼吸的缺乏。图21C示出了 B2-MWFE细胞(其是补充有野生型中国仓鼠Ndufal cDNA的CCL16-B2细胞)中挽救的复合物I活性。图21D提供了示出苹果酸影响有效利用NADH生成底物的数据，所述底物例如丙酮酸(P)、异柠檬酸(I)、谷氨酸(G)和α-酮戊二酸(K) ( “PF”、“IF”、“GF”和“KF”分别指示与FCCP分开添加P、1、G和K ;“PGMIKF”指示与FCCP —起添加P、1、G和K)。在所有组中最后添加苹果酸(从左边起第三个箭头)，除了添加PGMIKF的组之外，该组接受苹果酸和其他底物。图2IE示出了原代β细胞中对于单个底物(P、G、M、1、K)的复合物I依赖性呼吸的缺乏(“PA”、“GA”、“MA”、“ΙΑ”和“KA”分别指示与ImM ADP分开添加P、G、1、M和K)。琥珀酸支持的呼吸(SA)用作阳性对照。SA组在第三次注射时接受2 μ M FCCP,而其他组接受IOmM琥珀酸。图21F示出了与INSlE细胞相比的大鼠星形细胞中的复合物I依赖性呼吸。在2μ M鱼藤酮存在(星形细胞_GM+R0T、INS1E_GM+R0T)和不存在(星形细胞_GM、INS1E_GM)下监测星形细胞和ISlE细胞中的Glu+Mal支持的呼吸。
[0070]图22A至22B示出了寡霉素处理对底物供应至β细胞ETC/RC的作用。如实施例中所述使INSlE细胞生长并饥饿。图22k示出了在寡霉素存在下INSlE细胞中的进行性呼吸衰退。在1.3mM CaCl2存在下将包含2mM葡萄糖的LKB缓冲液用于测定；不添加EGTA。在2mM葡萄糖中测量基础呼吸速率之后，添加14.7mM葡萄糖或IOmM丙酮酸(左侧箭头)以测量呼吸刺激。随后，在约90分钟后，添加2ug / ml寡霉素(寡霉素)。对照组仅接受缓冲液。图22B示出了寡霉素对INSlE细胞的ETC/RC功能的作用。具有16.7mM葡萄糖并且不添加EGTA的不含Ca2+的LKB缓冲液用于测定。在进行测定之前，将β细胞在16.7mM葡萄糖中孵育约60分钟。在指示时间点用2 μ g / ml寡霉素(寡霉素)处理所有的组,然后在土nPFO下接受IOmM琥珀酸和/或2 μ M FCCP。“对照”指示仅缓冲液；“SuCC+FCCP”指示仅琥珀酸+FCCP (无 PFO) ;“nPF0+FCCP_Succ” 指示 nPFO+FCCP 之后添加琥珀酸；“nPF0+Succ+FCCP”指示一起添加nPFO+琥珀酸+FCCP。
[0071]图23A至23B示出了使用完整细胞进行FCCP滴定的结果。以指定细胞密度接种HEK293细胞，然后使用含有1.3M CaCl2和15mM葡萄糖而不添加EGTA的LKB缓冲液如实施例8所述地进行呼吸测定。图23A示出了得自于XF24分析仪的实际图。使用部分A、B、C和D进行I μ MFCCP的连续添加，分别导致1、2、3和4 μ M FCCP的累积浓度。图23Β示出了基础呼吸速率和最大呼吸速率与细胞密度的线性关系。使用来自图23Α中速率3 (无FCCP)和6(含有2μΜ FCCP)的数据。
[0072]图24A至24B示出了与洋地黄皂苷相比的某些细胞透化剂的相对性能。如实施例8所述使INSlE细胞生长并进行测定。用指定试剂透化β细胞并在琥珀酸(IOmM)、ADP(lmM)和Cyt C(IOyM)存在下监测呼吸。图23A示出了与皂苷(5至25 μ g / ml SAP)透化细胞相比的洋地黄皂苷(0.01% DIG)的相对线粒体功能。图23B示出了与丙甲甘肽(3至30 μ g / ml ALA)透化细胞相比的洋地黄皂苷(0.01% DIG)的相对线粒体功能。
[0073]图25A至25F示出了不同PFO变体的相对性能和DTT对呼吸的作用。在不含Ca2+的LKB (图25A)和HKB (图25B)缓冲液中测定nPFO透化HEK293细胞和rPFO透化HEK293细胞中的呼吸速率。图25C中示出了在将基础呼吸速率设定为100%之后来自图25A和25B组的rPFO数据。图25D示出了使用INSlE细胞的nPFO与dbPFO的比较。在含有2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB中进行测定并用`InM nPFO或InM dbPFO+ImM DTT透化细胞。图25E示出了 ImM DTT对透化INSlE细胞之呼吸的作用。图25F示出了 ImM DTT对完整INSlE细胞之呼吸的作用。
[0074]图26A示出了 rPFO透化INSlE细胞。在V7培养板中的实验结束时在显微镜下观察用InM rPFO透化的细胞。碘化丙啶(PI)染色用于确认完全透化(下图)，其由细胞质肿胀(上图)可明显看出。图26B示出了 B2-MWFE细胞的经dbPFO介导的透化。使用IOOnMDTT在InM dbPFO处理的细胞中诱导孔的形成。
[0075]图27示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物对于膜结合的胆固醇依赖性。使用如实验过程中所述的固有Trp荧光来测定结合的PFO衍生物(0.1 μ M终浓度)与具有变化的胆固醇含量以及比例恒定为1:1:1的P0PC、P0PE和SM的脂质体(0.2mM总脂质终浓度)的分数。示出了对于多种衍生物的胆固醇依赖结合等温线:nPF0(PF0)(方形)、rPF0(圆形)、rPF0D434s(向上三角形)和dbPF0D434s_G459A(向下三角形)。数据点是至少两次测量的平均值土标准偏差。
[0076]图28示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物在线粒体功能测定中的相对性能。使用两种不同浓度(0.1nM、1.0nM)的nPFO、rPFO和rPF0D434s (参见表5)透化HEK293细胞。随后一起添加琥珀酸(Succ:10mM)和FCCP(3mM)以测量最大呼吸活性。图28A示出了 0.1nM下的相对性能。图28B示出了 1.0nM下的相对性能。图28C示出了在0.1和1.0nM两种浓度下nPFO活性的比较。图28D示出了在两种浓度(0.1和1.0nM)下PFO变体之中活性的比较。在LPBT缓冲液中进行测定(参见表6)。
[0077]图29示出了洋地黄皂苷介导的细胞透化不得到稳定呼吸。在不同浓度的洋地黄皂苷DIG)存在下透化细胞并使用琥珀酸作为底物监测ADP刺激的呼吸。在LKB或LPBT缓冲液中进行测定(参见表6)。图29A和29B示出了 LKB缓冲液中洋地黄皂苷浓度与呼吸活性之间的反比关系。图29A中，在透化之前琥珀酸存在于介质中并且在图29B中将其与ADP—起添加。比较两组中的箭头ADP和Succ+ADP。对饥饿的INSlE细胞进行测定。图29C和29D示出了用于非饥饿INSlE细胞的呼吸缓冲液的作用。在所测试的所有洋地黄皂苷浓度下，LKB缓冲液(图29C)中的呼吸衰退比LPBT (图29D)中的呼吸衰退快。图29E和29F示出了通过洋地黄皂苷的细胞色素c丢失与呼吸衰退有关。即使在用于LKB & LPBT缓冲液二者的最高洋地黄皂苷浓度(0.01%)下，与琥珀酸+ADP—起添加外源性细胞色素c(CC)也抑制呼吸衰退。
[0078]图30示出了与高K+ (HPBT)缓冲液相比低K+ (LPBT缓冲液)对INSlE细胞生物能学的作用。图30A示出了添加寡霉素(寡霉素；Iyg / ml)之后的呼吸衰退和对解偶联剂FCCP (2 μ Μ)的响应。图30Β示出了在速率4下将基线设定为100%而重新绘制的图30Α的数据。在高K+缓冲液(HPBT)中描绘了更快速的衰退并且对FCCP无响应。
[0079]图31示出了鱼藤酮对完整细胞中总细胞呼吸和对PFO透化细胞中复合物I活性的剂量依赖性作用。图31Α和31D示出了 LKB (图31Α)和LPBT (图31D)缓冲液中经鱼藤酮处理之ΗΕΚ293人细胞的基线归一化呼吸速率(“Rot”指示在箭头处添加0、10、20、50 &1000mM鱼藤酮；“P / GM /` A”指示 InM rPFO、谷氨酸 + 苹果酸(每个 IOmM)、ImM ADP & 3 μ MFCCP succ”指示IOmM琥珀酸)。图3IB和31E示出了分别由图3IA和3ID的数据绘制的呼吸速率和鱼藤酮浓度(“基础”指示完整细胞呼吸的衰退；“Glu+Mal”指示FCCP存在下的复合物I依赖性呼吸；“succ”指示FCCP存在下的复合物II依赖性呼吸)。图31C示出了不同鱼藤酮剂量下复合物I和II依赖性呼吸的抑制百分比(“LKB-CI，CII”指示LKB缓冲液中复合物I和II的功能；“LPBT-CI，II”指示LPBT缓冲液中复合物I和II的功能)。图31F示出了在LKB缓冲液(虚线)和LPBT缓冲液(实线)中基础复合物I抑制(完整细胞中)与最大复合物I抑制(透化细胞中)之间的关系。在最大鱼藤酮剂量(I μ Μ)下，在基础和最大之间以及在缓冲液之间没有观察到显著差异(参见图31Β和31Ε)。
[0080]图32示出了 NdufalS55A来源的MEF中降低的呼吸活性。图32A至32B示出了WT和S55A MEF的基础呼吸速率与最大呼吸速率之间的差异。通过使用增加剂量的FCCP (2至4μΜ)测定了最大呼吸。图32C至32D示出了通过重组产气荚膜梭菌溶血素O(rPFO)透化的细胞中的呼吸活性。通过在ADP+FCCP存在下使用特定底物测量复合物I和II的活性(“Glu+Mal”指示谷氨酸+苹果酸并且“succ”指示琥珀酸)。在V7板中使100，000个细胞/孔旋转减慢(spin down)并在培养4小时后进行测量。
[0081]发明的某些实施方案的详述
[0082]在一些实施方案中，本发明的方面涉及用于线粒体功能的简单且可重现的测定。在一些实施方案中，可以以试剂盒提供一种或更多种测定组分。本发明的方面涉及这样的出乎意料的发现:基于细胞溶素(例如，基于产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))的细胞透化消除了对分离线粒体的需要，并且维持了线粒体周围的细胞微环境。这允许在接近生理条件下进行功能测定。
[0083]根据一些方面，本发明涉及胆固醇依赖性细胞溶素。本文使用的“胆固醇依赖性细胞溶素”是以胆固醇敏感方式在基于脂质的膜中形成孔的蛋白质的家族成员。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是由革兰氏阳性菌分泌的成孔毒素(pore-formingtoxin)。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素具有特征性的β桶形结构。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是在靶细胞膜表面上寡聚化的单体蛋白质。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素在靶细胞膜表面处形成环形孔前(pre-pore)复合物，并且将大的β桶插入膜中。在一些实施方案中，孔形成需要靶膜中存在胆固醇。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素选择性透化胞浆膜而不损害线粒体膜。表1中提供了胆固醇依赖性细胞溶素的非限制性实例。其他实例对于本领域技术人员来说是显而易见的。在一些具体实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
[0084]根据本发明的一些方面，通过胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)选择性透化细胞膜而不损害线粒体膜，这可用于测量线粒体代谢物的测定。许多线粒体代谢物容易穿过线粒体膜进入胞浆和从胞浆穿过线粒体膜。但是，这些代谢物不容易穿过细胞膜。这使得在不破坏细胞的情况下和在破坏线粒体天然生理环境的过程中难以测定这些代谢物。出乎意料地，已发现胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)透化细胞膜足以使得线粒体代谢物能够进入和离开细胞。在一些实施方案中，这允许通过测量一种或更多种线粒体代谢物的细胞外水平来评价线粒体活性。根据本发明的一些方面，由于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，PF0)使得 细胞膜对于线粒体代谢物能够透化并且不破坏线粒体膜，所以其选择性是有用的。在一些实施方案中，这允许在其自然细胞环境中评价线粒体的活性。
[0085]根据本发明的一些方面，提供了基于PFO的细胞透化方法用于线粒体功能测定。所述方法通常可用于不同的细胞类型(例如，建立的细胞系和原代细胞)。本文中还提供了提供用于所述方法之试剂的试剂盒。在一些实施方案中，这些试剂盒可用于测定复合物1、
I1、II1、IV和/或V、氧化磷酸化(OxPhos)能力和/或呼吸(ETC / RC)能力。因此，在一些实施方案中，提供了用于线粒体功能的简单且可重现的测定。在一些方面中，所述测定和试剂盒提供了用于线粒体功能障碍的诊断工具。在一些实施方案中，本发明的方面可用于理解线粒体代谢在病理生理学中的作用。在一些实施方案中，本发明的方面提供了用于线粒体疾病的诊断工具。
[0086]在一些实施方案中，基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如，基于PF0)的细胞透化消除了对分离线粒体的需要，并且维持了线粒体周围的细胞微环境。这允许在接近生理条件下使用测定技术(例如使用基于微板的呼吸计量法)进行线粒体功能测定，所述测定技术包括测量细胞代谢物(例如，线粒体代谢物)的摄入、释放、消耗和/或产生。这还允许检查不透膜试剂(membrane impermeable agent)对线粒体功能的作用。
[0087]表1:胆固醇依赖性细胞溶素的非限制性实例
[0088]
【权利要求】
1.方法，其包括: (a)使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触；以及 (b)测定所述制备物中分子的水平，其中所述分子的水平指示所述细胞的细胞内功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子的水平指示线粒体功能。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素包含选自表1的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O (PFO)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸，并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替 换。
9.根据权利要求7所述的方法，其还包括向所述制备物中添加还原剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子是02。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述制备物中O2的水平指示所述细胞的耗氧率。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述耗氧率指示线粒体功能。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述分子是H+。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述制备物中H+的水平指示所述细胞的H+产生速率。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与细胞呼吸效应物相接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
19.根据权利要求18所述的方法，其还包括测量所述细胞的耗氧率，其中ADP刺激的耗氧率指示所述细胞中的氧化磷酸化。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括测量所述细胞的耗氧率，其中FCCP刺激的耗氧率指示所述细胞中的电子传递和呼吸链功能。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸盐或其组合相接触。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物I (NADH-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与琥珀酸/琥珀酸盐相接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与甘油-3-磷酸相接触。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物III(泛醇-细胞色素c氧化还原酶)的酶活性。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺(TMPD)和/或抗坏血酸/抗坏血酸盐相接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法的结果还指示所述细胞中复合物IV(细胞色素c氧化酶)的酶活性。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与琥珀酸/琥珀酸盐和ADP相接触。
31.根据权利要求30所述的方法，其还包括使所述细胞与甘油-3-磷酸相接触。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述方法的结果还指示所述细胞中复合物V (ATP合酶)的酶活性。`
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂相接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抑制剂是鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN和寡霉素。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与测试剂相接触以及测定所述测试剂对所述细胞内功能的作用。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述测试剂是候选药物。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括鉴定所述细胞中的一个或更多个基因突变，其中所述方法的结果指示所述一个或更多个基因突变是否影响所述细胞的所述细胞内功能。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞从患有或疑似患有线粒体疾病的个体获得。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法的结果有助于将所述个体诊断为患有所述线粒体疾病。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制备物被包含在孔中。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述孔位于多孔板中。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞是动物细胞或植物细胞。
43.方法，其包括: (a)使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触；以及 (b)测量所述细胞的细胞内功能。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞内功能是所述细胞的代谢速率、所述细胞的呼吸速率、有氧呼吸与无氧呼吸的比例、分子的消耗速率或分子的产生速率。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述细胞内功能指示细胞健康或细胞生存力。
46.根据前述权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述细胞内功能是线粒体功倉泛。
47.根据前述权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
48.根据前述权利要求43至47中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与细胞呼吸效应物相接触。
49.根据前述权利要求43至48中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与测试剂相接触以及测定所述测试剂对所述细胞内功能的作用。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述测试剂是候选药物。
51.根据前述权利要求43至50中任一项所述的方法，其还包括鉴定所述细胞中的一个或更多个基因突变，其中所述方法的结果指示所述一个或更多个基因突变是否影响所述细胞的所述细胞内功能。
52.根据前述权利要求43至51中任一项所述的方法，其中所述细胞得自于患有或疑似患有线粒体疾病的个体。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法的结果有助于将所述个体诊断为患有所述线粒体疾病。
54.根据前述权利要求43至53中任一项所述的方法，其中包含所述细胞的所述制备物处于多孔板的孔中。
55.试剂盒，其包含: 容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器；和 容纳有用于评价细胞之细胞内功能的试剂的容器。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述细胞内功能是线粒体功能。
57.试剂盒，其包含: 容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器；和 容纳有细胞呼吸效应物的容器。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
61.根据前述权利要求55至60中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α -酮戊二酸/α-酮戊二酸盐或其组合的容器。
62.根据前述权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有琥珀酸/琥珀酸盐的容器。
63.根据前述权利要求55至62中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有甘油-3-磷酸的容器。
64.根据前述权利要求55至63中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有N，N,Ni，N'-四甲基对苯二胺(TMPD)的容器。
65.根据前述权利要求55至64中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有抗坏血酸/抗坏血酸盐的容器。
66.根据前述权利要求55至65中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂的容器。
67.根据前述权利要求55至66中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。
68.根据前述权利要求55至67中任一项所述的试剂盒，其还包含容纳有测定缓冲剂的容器。
69.根据前述权利要求55至68中任一项所述的试剂盒，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素选自表1。
70.根据前述权利要求55至69中任一项所述的试剂盒，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
71.根据权利要求70所述的试剂盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列。
72.根据权利要求70所述的试剂盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
73.根据权利要求70所述的试剂盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸，并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的试剂盒，其中所述PFO还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替换。
75.根据权利要求73所述的试剂盒，其还包含容纳有还原剂的容器。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
77.根据前述权利要求55至76中任一项所述的试剂盒，其中至少一个容器是可重复使用的容器。
78.根据前述权利要求55至77中任一项所述的试剂盒，其中至少一个容器是单次使用的容器。
79.根据前述权利要求55至78中任一项所述的试剂盒，其中至少一个容器是管或瓶。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述管或瓶是按扣盖的管或瓶或者螺旋盖的管或瓶。
81.根据前述权利要求55至80中任一项所述的试剂盒，其中至少一个容器是玻璃小瓶。
82.根据前述权利要求55至81中任一项所述的试剂盒，其中所述容器一起被容纳在盒子或包装中。
83.根据前述权利要求55至82中任一项所述的试剂盒，其还包含用于使细胞透化的说明书。
84.根据前述权利要求55至83中任一项所述的试剂盒，其还包含用于在使用前将至少一个容器保存在低于0°C的温度的说明书。
85.根据前述权利要求55至84中任一项所述的试剂盒，其还包含用于诊断用途的说明书。
86.根据前述权利要求55至85中任一项所述的试剂盒，其还包含用于进行根据权利要求I至42中任一项所述之方法的说明书。
87.分离的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)，其包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸。
88.根据权利要求87所述的分离的PF0，其还在319位氨基酸处包含苏氨酸至半胱氨酸的替换。
89.根据权利要求87或88所述的分离的PF0，其还在334位氨基酸处包含缬氨酸至半胱氨酸的替换。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的分离的PF0，其还在459位氨基酸处包含半胱氨酸至丙氨酸的替换。
91.分离的PF0，其包含如SEQID NO:8至12中任一所示的氨基酸序列。
92.组合物，其包含根据权利要求87至91中任一项所述的分离的PFO以及载体。
93.试剂盒，其包含容纳有根据权利要求87至91中任一项所述的分离的PFO或容纳有根据权利要求92所述之组合物的容器。
94.用外源性核酸转染细胞的方法，所述方法包括: (a)使所述细胞与胆固醇依赖性细胞溶素相接触；以及 (b)使所述细胞与所述外源性核酸相接触。
95.根据权利要求94所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前进行。
96.根据权利要求94所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
100.根据权利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸，并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
101.根据权利要求99或100所述的方法，其中所述氨基酸序列还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替换。
102.方法，其包括: 使包含从对象得到之细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触；以及 测定所述制备物中分子的水平，其中所述分子的水平指示所述细胞中呼吸链缺陷的存在与否。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述细胞中所述呼吸链缺陷的存在指示所述对象患有线粒体疾病。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述线粒体疾病选自:肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(MERRF);线粒体肌病、脑病、高乳酸血症和卒中(MELAS);糖尿病和耳聋(DAD);母体遗传糖尿病和耳聋(MIDD);莱伯遗传性视神经病(LHON);慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)；利氏病；卡恩斯-赛尔综合症(KSS);弗里德赖希共济失调(FRDA);辅酶QIO(Co-QIO)缺陷；神经病、共济失调、色素性视网膜炎及上睑下垂(NARP);肌神经源性胃肠性脑病(MNGIE)；复合物I缺陷；复合物II缺陷；复合物III缺陷；复合物IV缺陷；复合物V缺陷；其他线粒体疾病；以及影响线粒 体功能的其他肌病。
【文档编号】C12Q1/26GK103687959SQ201280027623
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年4月6日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】纳根德拉·亚达瓦, 金澈, 亚历杭德罗·帕布洛·霍伊克 申请人:贝斯泰医学中心公司, 马萨诸塞大学