专利名称：一种分离乳酸杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种分离乳酸杆菌的方法，方法易行，操作简便，不需常规分离方法中的厌氧设备。
背景技术：
乳酸杆菌属于乳酸杆菌科，拉丁学名为Lactobacillus，是指能使糖类发酵产生乳酸的细菌，其存在广泛，嗜酸，最适合PH5. 5 6，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强，细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢；肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的繁殖，具有维护人体和动物健康和调节免疫的功能。中国农业部已经批准乳酸杆菌可以作为饲料添加剂中的微生物菌种用于饲料和养殖业中。现有技术中，一般常规分离乳酸杆菌的方法需要厌氧设备，比如厌氧操作台，厌氧罐等，但在很多地方，特别是企业，由于条件限制而没有这些设备；同时，乳酸杆菌离开机体后很快就会死亡，如果样品采集地点离乳酸杆菌分离地点很远，那么样品中的乳酸杆菌在运送过程中就可能已经死亡，现有技术不能把仪器设备运到样品采集地点进行乳酸杆菌分离，不能解决样品采集地点和分离地点距离太远这个问题。本发明方法通过向培养器皿中充入二氧化碳气体至培养基中氧气消耗殆尽，然后用封口膜密封，人为形成一个厌氧环境，与现有技术相比，本发明方法具有良好的优势，不需要常规方法所必须的厌氧设备，同时能够在样品采集地点进行乳酸杆菌的分离培养，不需要将样品带到实验室后才能进行分离培养，能有效解决实 践生产过程中存在的上述两个问题。为从样品中更方便、及时的筛选出乳酸杆菌(Lactobacillus)，本发明了公开一种分离乳酸杆菌的方法，运用该方法成功分离得到了乳酸杆菌，该方法可以用于实验室乳酸杆菌的分离，同时适合在样品采集地点进行乳酸杆菌的野外分离，减少工作量。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种分离乳酸杆菌的方法，方法易行，操作简便，不需常规分离方法中的厌氧设备。乳酸杆菌的分离一般需要两个条件，一是选择性培养基，目前通用的乳酸杆菌分离培养基为MRS培养基；二是分离过程中需要一个相对厌氧的生长环境。本发明选用MRS乳酸杆菌分离培养基，然后通过营造一个适合乳酸杆菌生长的厌氧环境(现有的方法都需要特定仪器设备)，从而将乳酸杆菌分离出来。具体操作如下将配制的MRS固体培养基调节pH6. 0-6. 6后，装入100-150毫升培养基于250毫升生理盐水瓶中，充入二氧化碳气体至培养基中氧气消耗殆尽，用橡胶盖塞住瓶口，然后用封口膜密封，人为形成一个厌氧环境，置于灭菌锅115°C灭菌13-18分钟，以45度角倾斜放置，使培养基形成斜面，自然冷却到培养基凝固，将所要分离的样品稀释液用注射器注入生理盐水瓶中的斜面培养基上，将生理盐水瓶倒置于生化培养箱中29_31°C恒温培养46-50小时,乳酸杆菌将在生理盐水瓶的斜面培养基上被分离出来。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种分离乳酸杆菌的方法，其步骤是将配制的MRS固体培养基调节pH6. 0-6. 6后，装入100-150毫升培养基于250毫升生理盐水瓶中，充入二氧化碳气体至培养基中氧气消耗殆尽，将一细线的一端置于瓶内，另一端置于瓶外，用橡胶盖塞住瓶口，然后用封口膜密封，置于灭菌锅115°C灭菌13-18分钟，拔掉细线，以45度角倾斜放置，使培养基形成斜面，自然冷却到培养基凝固；将待分离的样品用无菌双蒸水以体积比1:10混合，涡旋一分钟后静置3-6分钟；移取上清I毫升进行10倍倍比稀释，然后分别取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5三个稀释度各200微升样品，用注射器注入A步中所制备的装有固体培养基的250毫升生理盐水瓶中，用蜡密封好注射过程中注射器留在生理盐水瓶上橡胶塞的注射孔，转动生理盐水瓶，使样品均匀分布在生理盐水瓶中培养基的斜面上；将生理盐水瓶倒置于生化培养箱中29_31°C恒温培养46-50小时,乳酸杆菌将在生理盐水瓶的斜面培养基上被分离出来。所述MRS固体培养基为
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牛Λ蛋 粉842
Λ肉沂8-12
猜姆设出斤粉 3-7 葡萄糖18-22
醋酸钠3-7
柠If酸二鑛1-3
吐温 800.08- 0.2
酸酸镁0.48- 0.68
S 酸蜢0.18-0.38
琼脂粉13-17
蒸溜水800-1200,与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明提供的分离乳酸杆菌的方法，无需厌氧培养相关器皿，也不需要二氧化碳培养箱。通过将二氧化碳气体充入装有培养基的生理盐水瓶中，消耗培养基和生理盐水瓶中的氧气，构建一个适合乳酸杆菌生长的厌氧环境，为乳酸杆菌的分离找到一种简单、方便的方法。该方法更方便、及时，并显著减少了工作量。
图1为一种分离乳酸杆菌的方法流程示意图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。下面结合附图对本发明作进一步详细描述实施例1 :一种分离乳酸杆菌的方法，其步骤是A. MRS固体培养基配制培养基配方为牛肉蛋白粉10g、鱼肉汁10g、酵母浸出汁粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、硫酸镁O. 58g、硫酸锰O. 28g、琼脂粉15g，加I毫升吐温80，溶解于蒸溜水1000中，调节pH值为6或6. 2或6. 3或6. 4或6. 6后，充入二氧化碳气体直至培养基和生理盐水瓶中的氧气消耗殆尽，将一细线的一端置于瓶内，另一端置于瓶外，用橡胶盖塞住瓶口，然后用封口膜密封，置于灭菌锅115°C灭菌13或14或15或16或17分钟，与水平面成45度角倾斜放置，自然冷却直至培养基凝固。B.样品准备分别制备罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri,来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1. 2838，摇瓶培养，菌液浓度为106cfu/ml)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus,来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1. 1854，摇瓶培养，菌液浓度为106cfu/ml)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius,来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1. 0006,摇瓶培养，菌液浓度为106cfu/ml)、非解乳链球菌(Streptococcus alactolyticus,来源于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号CICC21028摇瓶培养，菌液浓度为IO6Cfu/ml)、大肠杆菌(Escherichia coli,来源于中国微生物菌种保藏中心,保藏编号CAU0786,摇瓶培养，菌液浓度为106cfu/ml)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,来源于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号YZU0499，摇瓶培养，菌液浓度为106cfu/ml)、粘膜乳酸杆菌(Lactobacillus mucosae,来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1. 3259)，摇瓶培 养，菌液浓度为106cfu/ml)菌液，各菌液体按体积比等比例混合后，取I毫升细菌混合样品，用无菌双蒸水以体积比1:10混合，涡旋30秒。C.样品接种移取I毫升B步中所制备的菌液进行10倍倍比稀释，然后分别取10_4、10' IO-5三个稀释度各200微升样品，用注射器注入生理盐水瓶中的斜面培养基，轻轻转动生理盐水瓶，使样品均匀分布在斜面培养基上；D.分离培养用蜡将生理盐水瓶橡胶盖上的注射器针孔密封，倒置于生化培养箱中29或30或31°C恒温培养46或47或48或49或50小时，在培养基斜面上，出现乳白色、圆形、凸起、边缘整齐、不透明的菌落，初步判断为乳酸杆菌，再通过16S rDNA测序方法对生长出来的菌落克隆进行16S rDNA测序，然后在NCBI数据库中运用BLASTN软件进行序列比对，对所分离的乳酸杆菌进行进一步的确认，挑选36个细菌的16S rDNA进行了测序分析，其结果如表I。结果显示，不属于乳酸菌的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有生长，属于乳酸杆菌的罗伊乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和粘膜乳酸杆菌都有生长，属于乳酸菌但不属于乳酸杆菌的非解乳链球菌也有生长，表明混合菌液被很好的分离，该方法不但能分离乳酸杆菌，同时也能分离部分其它的乳酸菌，比如链球菌属中的细菌。用该方法分离乳酸杆菌，无需厌氧培养相关器皿，也不需要二氧化碳培养箱。通过将二氧化碳气体充入装有培养基的生理盐水瓶中，消耗培养基和生理盐水瓶中的氧气，构建一个适合乳酸杆菌生长的厌氧环境，为乳酸杆菌的分离找到一种简单、方便的方法。该方法更方便、及时，且能在野外对样品中的乳酸杆菌进行分离，并显著减少了工作量。因此，该方法对乳酸杆菌的分离，特别是对乳酸杆菌的野外分离以及在缺乏厌氧菌分离仪器的地方具有重要的指导意义和现实需求。表 I
权利要求
1.一种分离乳酸杆菌的方法，其步骤是 将配制的MRS固体培养基调节pH6. 0-6. 6后，装入100-150毫升培养基于250毫升生理盐水瓶中，充入ニ氧化碳气体至培养基中氧气消耗殆尽，将ー细线的一端置于瓶内，另ー端置于瓶外，用橡胶盖塞住瓶ロ，然后用封ロ膜密封，置于灭菌锅115で灭菌13-18分钟，拔掉细线，以45度角倾斜放置，使培养基形成斜面，自然冷却到培养基凝固； 将待分离的样品用无菌双蒸水以体积比1:10混合，涡旋一分钟后静置3-6分钟； 移取上清I毫升进行10倍倍比稀释，然后分别取lO'lO'lO—5三个稀释度各200微升样品，用注射器注入A步中所制备的装有固体培养基的250毫升生理盐水瓶中，用蜡密封好注射过程中注射器留在生理盐水瓶上橡胶塞的注射孔，转动生理盐水瓶，使样品均匀分布在生理盐水瓶中培养基的斜面上； 将生理盐水瓶倒置于生化培养箱中29-3TC恒温培养46-50小时,乳酸杆菌在生理盐水瓶的斜面培养基上被分离出来； 所述MRS固体培养基为 组成成份重量份 牛肉蛋白粉 8-12 鱼肉汁8-12 酵母浸出汁粉 3-7 葡萄糖18-22 醋酸钠3-7 柠檬酸ニ铵1-3 吐温 800. 08- 0. 2 硫酸镁0. 48- 0. 68 硫酸锰0. 18- 0. 38 琼脂粉13-17 蒸溜水800-1200。
全文摘要
本发明公开了一种分离乳酸杆菌的方法，其步骤是A、将MRS固体培养基调节pH后装入生理盐水瓶，充入二氧化碳使培养基中氧气消耗殆尽，密封，灭菌，45度倾斜放置，培养基形成斜面，自然冷却；B、将待分离的样品用无菌双蒸水混合，涡旋后静置；C、移取上清进行稀释，分别取10-3、10-4、10-5三个稀释，分别用注射器注入到生理盐水瓶的斜面上，转动生理盐水瓶，使样品均匀分布在生理盐水瓶中的斜面培养基上；D、倒置于生化培养箱中培养，乳酸杆菌将在培养基表面被分离出来。方法易行，操作简便，该方法可以用于实验室乳酸杆菌的分离，同时适合在样品采集地点进行乳酸杆菌的野外分离，并显著减少工作量。
文档编号C12R1/225GK103045523SQ20131001000
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者王升平, 印遇龙, 李丽立, 熊霞, 范觉鑫, 刘惠知, 周映华, 胡新旭, 高书峰, 周小玲, 缪东, 舒燕, 曾发姣 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所