专利名称：一种水稻OsICE1基因双元载体及其应用方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻OsICEl基因双元载体及其应用方法。
背景技术：
植物的生长发育过程受到各种环境因素的影响，其中冷害是影响农作物产量和品质的主要因素之一。研究表明大量逆境应答基因的表达可提闻植物获得抗逆性的品质(Gong et al.，2002)。逆境应答基因的克隆和转化是获得抗逆性植株的主要方式，其中基因载体的构建是其中关键的环节之一，而双元载体的构建和应用为筛选阳性植株，及获取目的基因的表达产物提供了便利。
ICEl (Inducers of CBF expression)编码一个 bHLH(basic helix-loop-helix)类型的转录因子，这个转录因子在低温诱导下可以与CBF3启动子上顺式作用元件相互结合，并激活CBF3的转录。OsICEl是CBF诱导因子在水稻中的同系物，呈组成性表达。OsICEl不受或很少受冷胁迫诱导，它对冷和盐胁迫的应答是在蛋白质水平被诱导的，即主要在翻译后被调控。OsICEl是ー个膜相关的转录因子，调控冷胁迫诱导的上游转录因子基因如OsDREBIB和0sHsfA3的表达，从而使水稻适应寒冷环境，OsICEl可能涉及到海藻糖的生物合成途径(Nakamura et al. , 2011)。
发明内容
针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种水稻OsICEl基因的应用方法。本发明实施例的目的在于提供一种水稻OsICEl基因的双元载体，该双元载体包括 Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CE1-FLAG:NOS，Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1CEl-MYC:NOS 与ICEl-antisense 载体。本发明实施例的另一目的在于提供一种水稻OsICEl基因的应用方法，其特征在于，该应用方法把构建的OsICEl基因的五种表达载体Pub1:1CEl:N0S，Pub1:1CE1-FLAG: NOS，Pub1:1CEl-HA: NOS, Pub1:1CEl-MYC: NOS 和 ICEl-antisense 转入水稻受体材料日本睛中，经繁殖传代，获得Tl代转基因植株。进ー步，该应用方法还包括以下步骤(1)总RNA的提取水稻材料日本睛的种子经25%的次氯酸钠消毒，转入发芽盒中萌发，胚芽长至2cm时挑选植株大小一致的水稻植株，移入人工气候箱中的培养箱内生长，营养液为Hogland培养液。姆两天换一次培养液，到四叶一心期时，称取0. 2克叶片，在研钵中倒入液氮速冻、研碎，研磨充分后转入1. 5毫升的离心管中，迅速加入I毫升Trizol试剂(购于晶美生物工程有限公司)，40°C下12000g离心lOmin。取上清,加入0. 2毫升的氯仿，荡后放置2-3min。40°C下12000g离心15min,吸上层水相至新1. 5ml离心管中。加0. 5ml氯仿,剧烈振荡后放置2_3min ;40°C下12000g离心15min,把上层水相转入1. 5ml离心管中，加入0. 5ml的异丙醇，振荡后放置IOmin,40°C下12000g离心后弃去上清，沉淀即为RNA。加入Iml 70%こ醇洗涤沉淀，40°C下12000g离心5min，去上清。沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中。取I y IRNA溶液，用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。(2) cDNA合成取上述提取的RNA样品5 ii g，加入50 ii molじ1 Oligo dT I yl，再加1%。DEPC水补足lOiil。70°C水浴中5min后，再依次加入Rnase inhibitor 0. 5 yl和5 X RT buffer 5u I, IOmM dNTP 2. 5u I, M-MLV 反转录酶 I ii 1，1%。DEPC 水补足至 25 y I。42°C水浴I h后，再75°C水浴15min终止反应，_80°C保存。(3) OsICEl基因cDNA全长的获得用AtICEl基因(AT3G26744.1)序列在NCBI核酸数据库中搜索水稻同源基因，获得与AtICEl相似性为57%的水稻基因序列(编号为0sllg052370)，依据该同源基因0sllg052370的序列设计引物，用上述获得的水稻材料日本睛总cDNA为模板，设计PCR引物，引物序列为
OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’该PCR引物所扩增的区段包含完整的OsICEl阅读框。PCR反应程序如下94°C预变性4min，98°C变性10s，60°C复性延伸2min，35个循环后，72°C IOmin0扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带切割，用凝胶回收试剂盒进行产物回收。PCR产物回收后用pUCm-T载体连接。取5 ill连接产物加入大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，冰浴10_20min，42°C热激90秒，冰浴10分钟，加入500iil LB液体培养基，37°C摇床上低速(120-150 rpm)摇菌I小吋。取100 ill菌液均匀涂于含有100 u gmじ1安苄的LB固体培养基上生长12h_14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsICEl基因的cDNA序列与NCBI NM_001074519序列完全相同；获得含有目的基因OsICEl cDNA全长序列的重组质粒，命名为pICEl。4)表达载体pUb1-1CEl的构建根据水稻OsICEl基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICEl阅读框，并在上游和下游引物上分別引入限制性内切酶位点BamHI，弓丨物序列为ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上获得的pICEl质粒为模板，PCR程序如下94°C预变性4min，98°C变性10s，60°C复性延伸2min，35个循环后，72°C lOmin，扩增的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI进行单酶切，同时用BamH I单酶切表达载体质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4°C下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50 ii gmじ1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamHI酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30%甘油于_70°C保存，提取阳性克隆质粒命名为pUb1-1CEl。最后通过电击法将pUb1-1CEl质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50 u gmじ1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于_70°C保存，转基因备用。5)转基因植株的获得
侵染愈伤组织和共培养取水稻材料日本睛花后15 d的幼胚，用75 %こ醇浸泡I m in，再用25 %的次氯酸钠浸泡25-30 min,无菌水洗3 -4次，用异物针挑出幼胚，接种于诱导培养基上。将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液Iml于1.5ml离心管中，4°C，5000rpm,离心I min,去上清,用含200 u molじ1こ酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上浙干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25°C暗培养60h。洗菌和抗生素筛选培养将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无茵水清5次，姆次不停的振荡5min,再用含500mgじ1羧节青霉素car的无茵水浸泡40_60min,最后置于无菌滤纸上浙干2h，第一轮筛选将晾干的愈伤组织转入含250mgじ1羧苄青霉素car和50mgじ1潮霉素Hyg的选择培养基上进行第一次选择,30°C,光照培养14d ;第二轮筛选将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含25011^171羧苄青霉素car和80mgじ1潮霉素Hyg的选择培养基上，30°C，光照培养IOd然后转移到组培室中培养4d。
抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入分化培养基中，放入恒温培养室，组培室培养条件为24-30°C，14h光/8h暗，待苗长至5cm，放入生根培养基中壮苗。剪取待检测苗Icm长的新鲜绿色叶片，平放于含潮霉素SOmgI/1培养基上，30°C, 16h/8h光/暗培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死，通过潮霉素筛选得到阳性TO植株。TO代种子发芽后得到Tl代转基因苗，提取转基因Tl代苗不同株系叶片的总 RNA,反转录总 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’-GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’进行半定量PCR鉴定，结果具有727bp条带的，即为得到的稳定遗传的转基因株系。同时，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物进行PCR检测。本发明实施例的另ー目的在于提供ー种OsICEl转基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，其特征在干，首先，从转基因水稻植株冷胁迫表型方面观察OsICEl基因对冷胁迫的抗性表现；模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6°C下培养四天，观察到转基因植株C1-T12，C2-T25，C3-T7，C4-T5的长势优于对照植株，表现在植株高度、叶色和根长等性状；转基因植株C5-T21为OsICEl基因的反义表达载体转化的植株，其植株幼苗在6°C冷胁迫条件下培养四天，对冷胁迫反应较敏感。本发明实施例的另一目的在于公开水稻OsICEl基因抗冷性基因工程应用，基因来自水稻，可作为目的基因导入植物，提高植物的抗冷性，进行植物品种改良。本发明提供的功能基因的双元载体的构建及转基因技术在植物的抗逆性分子育种中具有较广泛的实践意义和广阔的应用前景。
图1是本发明实施例提供的OsICEl基因的载体图；图2是本发明实施例提供的部分转基因水稻的分化苗；图3是本发明实施例提供的各种载体的转基因株系；
图4是是OsICEl转基因植株与非转基因植株(WT)对冷胁迫的耐受表型.WT :非转基因植株，Cl Pub1:1CEl:NOS, C2 Pub1:1CEl -FLAG:NOS, C3 Pub1:1CEl -HA:NOS, C4 Pub1:1CEl -MYC:NOS, C5 ICEl-antisense ；图5本发明实施例提供的OsICEl转基因水稻植株在冷胁迫下的的存活率。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进ー步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。冷胁迫通过使植株生长迟缓和不可逆转的损伤，严重影响了作物产量。最近，拟南芥中的CBF表达的诱导因子(ICEl)已被鉴定为主要的诱导外源脱水应答转录因子/C-重复结合因子调节子(DREB/CBF)型的转录因子參与冷胁迫和滲透压胁迫下信号的传导。为了检测在寒冷条件下，水稻ICE同系物是否通过调节水稻DREB的同系物来对冷胁迫的作出反应，本发明实施例鉴定了ー个含有ICE特异基序多肽抗原决定簇。对水稻幼苗的冷胁迫诱导产生ー个分子量大约为55kDa的ICE相关蛋白。这个蛋白的分子量与预测的OsICEl的分子量一致。与该蛋白相比，冷胁迫对OsICEl的表达是没有明显的影响。半定量RT-PCR表明这个基因可以持续表达，但是冷胁迫却持续上调OsDREBIB，水稻热激转录因子A3 (0sHsfA3)和6-磷酸海藻糖磷酸酶(OsTPPl)的表达。结果表明，在转录调控中，OsICEl的功能在冷胁迫诱导转录因子上游涉及到OsDREBIB和0sHsfA3，从而能适应寒冷环境。本发明实施例提供的水稻OsICEl基因的克隆及测序方法。cDNA序列见序列表。1、双元载体的构建构建了 OsICEl基因的双元载体，包括Pub1:1CEl:N0S，Pub1:1 CE1-FLAG: NOS, Pub1:1 CE1-HA: NOS, Pub1:1CEl-MYC: NOS ;与 ICEl-antisense 载体。OsICEl基因的载体图如图1.(I)总RNA的提取水稻材料日本睛的种子经25%的次氯酸钠消毒，转入发芽盒中萌发，胚芽长至2cm时挑选植株大小一致的水稻植株，移入人工气候箱中的培养箱内生长，营养液为Hogland培养液。每两天换一次培养液，到四叶一心期时，称取0. 2克叶片，在研钵中倒入液氮速冻、研碎，研磨充分后转入1. 5毫升的离心管中，迅速加入I毫升Trizol试剂(购于晶美生物工程有限公司)，40°C下12000g离心lOmin。取上清，加入0. 2毫升的氯仿，荡后放置2-3min。40。。下12000g离心15min,吸上层水相至新1. 5ml离心管中。加
0.5ml氯仿,剧烈振荡后放置2_3min ;40°C下12000g离心15min,把上层水相转入1. 5ml离心管中，加入0.5ml的异丙醇，振荡后放置10min，40°C下12000g离心后弃去上清，沉淀即为RNA。加入Iml 70%こ醇洗涤沉淀，40°C下12000g离心5min，去上清。沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中。取I ii IRNA溶液，用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。
(2) cDNA合成取上述提取的RNA样品5 ii g，加入50 ii molじ1 Oligo dT I yl，再加1%。DEPC水补足lOiil。70°C水浴中5min后，再依次加入Rnase inhibitor 0. 5 yl和5 X RT buffer 5u I, IOmM dNTP 2. 5u I, M-MLV 反转录酶 I ii 1，1%。DEPC 水补足至 25 y I。42°C水浴I h后，再75°C水浴15min终止反应，_80°C保存。(3) OsICEl基因的cDNA全长的获得用AtICEl基因()序列在NCBI核酸数据库中捜索水稻同源基因序列，依据该同源序列设计引物，用上述获得的水稻材料日本睛总cDNA为模板，设计PCR引物，引物序列为OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’该PCR引物所扩增的区段包含完整的OsICEl阅读框。PCR反应程序如下94°C预变性4min，98°C变性10s，60°C复性延伸2min，35个循环后，72°C IOmin0扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带切割，用凝胶回收试剂盒进行产物回收。PCR产物回收后用pUCm-T载体连接。取5 ill连接产物加入大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，冰浴10_20min，42°C热激90秒，冰浴10分钟，加入500iil LB液体培养基，37°C摇床上低速(120-150 rpm)摇菌I小吋。取100 ill菌液均匀涂于含有100 u gmじ1安苄的LB固体培养基上生长12h_14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsICEl基因的cDNA序列与NCBI NM_001074519序列完全相同；获得含有目的基因OsICEl cDNA全长序列的重组质粒，命名为pICEl。
4)表达载体pUb1-1CEl的构建根据水稻OsICEl基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICEl阅读框，并在上游和下游引物上分別引入限制性内切酶位点BamHI，弓丨物序列为ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上获得的pICEl质粒为模板，PCR程序如下94°C预变性4min，98°C变性10s，60°C复性延伸2min，35个循环后，72°C lOmin，扩增的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI进行单酶切，同时用BamH I单酶切植物表达载体质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4°C下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50 y gmじ1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamHI酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30%甘油于_70°C保存，提取阳性克隆质粒命名为pUb1-1CEl。最后通过电击法将pUb1-1CEl质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50 u gmじ1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于_70°C保存，转基因备用。5)转基因植株的获得侵染愈伤组织和共培养取水稻材料日本睛花后15 d的幼胚，用75 %こ醇浸泡I m in，再用25 %的次氯酸钠浸泡25-30 min,无菌水洗3 -4次，用异物针挑出幼胚，接种于诱导培养基上。将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液Iml于1.5ml离心管中，4°C，5000rpm,离心I min,去上清,用含200 u molじ1こ酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上浙干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25°C暗培养60h。洗菌和抗生素筛选培养将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无茵水清5次，姆次不停的振荡5min,再用含500mgじ1羧节青霉素car的无茵水浸泡40_60min,最后置于无菌滤纸上浙干2h，第一轮筛选将晾干的愈伤组织转入含250mgじ1羧苄青霉素car和50mgL_1潮霉素Hyg的选择培养基上进行第一次选择,30°C,光照培养14d ;第二轮筛选将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含25011^171羧苄青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的选择培养基上，30°C，光照培养IOd然后转移到组培室中培养4d。抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入分化培养基中，放入恒温培养室，组培室培养条件为24-30°C，14h光/8h暗，待苗长至5cm，放入生根培养基中壮苗。剪取待检测苗Icm长的新鲜绿色叶片，平放于含潮霉素SOmgI/1培养基上，30°C, 16h/8h光/暗培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死，通过潮霉素筛选得到阳性TO植株。TO代种子发芽后得到Tl代转基因苗，提取转基因Tl代苗不同株系叶片的 总 RNA,反转录总 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’-GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’进行半定量PCR鉴定，结果具有727bp条带的，即为得到的稳定遗传的转基因株系。同时，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物进行PCR检测。农杆菌介导的水稻转化，A、部分转基因水稻的分化苗，如图2所示。B、含有不同载体的转基因水稻株系在温室生长和繁殖，图3为含有各种载体的转基因株系。2 OsICEl基因转基因水稻植株的阳性转化体的鉴定本项目前期工作中已经把构建的OsICEl基因的五种表达载体(包括Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CEl -FLAG:NOS，Pub1:1CEl -HA:NOS, Pub1:1CEl -MYC:NOS 和ICEl-antisense)转入水稻受体材料日本晴中，经繁殖传代，获得Tl代转基因植株。OsICEl转基因株系于校内生物科技园正常季节繁殖、海南加代，目前每个转化体已获得不同数目的株系。对获得的转基因T2代植株部分株系经过PCR鉴定，筛选阳性转化体，鉴定为阳性的转基因水稻的株系数如表I。表1. OsICEl转基因水稻植株的株系数
权利要求
1.一种水稻OsICEl基因的双元载体，该双元载体包括Pub1:1CEl :N0S， Pub1:1CE1-FLAG:NOS，Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1CEl-MYC:NOS 与 ICEl-antisense 载体。
2.一种水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法把构建的 OsICEl 基因的五种表达载体Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CE1-FLAG:NOS, Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1 CE1-MYCiNOS和ICEl-antisense转入水稻受体材料日本晴中，经繁殖传代，获得Tl 代转基因植株。
3.如权利要求2所述水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤总RNA的提取方法水稻材料日本晴的种子经25%的次氯酸钠消毒，转入发芽盒中萌发，胚芽长至2cm时挑选植株大小一致的水稻植株，移入人工气候箱中的培养箱内生长，营养液为Hogland培养液；每两天换一次培养液，到四叶一心期时，称取O. 2克叶片，在研钵中倒入液氮速冻、研碎，研磨充分后转入1. 5毫升的离心管中，迅速加入I毫升Trizol试剂，40°C下12000g离心IOmin ;取上清,加入O. 2毫升的氯仿,荡后放置2_3min ;40°C下12000g离心15min,吸上层水相至新1. 5ml离心管中；加O. 5ml氯仿,剧烈振荡后放置2_3min ;40°C下12000g离心 15min,把上层水相转入1. 5ml离心管中，加入O. 5ml的异丙醇，振荡后放置IOmin, 40°C下 12000g离心后弃去上清，沉淀即为RNA ;加入Iml 70%乙醇洗涤沉淀，40°C下12000g离心 5min,去上清；沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中；取I μ IRNA溶液，用分光光度计测定总 RNA的浓度和纯度。
4.如权利要求2所述水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤cDNA合成方法取上述提取的RNA样品5 μ g，加入50 μ mo 1Γ1 Oligo dT I μ I,再加I %。DEPC水补足 10 μ I ;70 °C 水浴中 5min 后，再依次加入 Rnase inhibitor 0.5y]^P5XRT buffer 5 μ I, IOmM dNTP 2· 5 μ 1，M_MLV 反转录酶 I μ 1，1%。DEPC水补足至 25 μ I; 42°C水浴 I h后， 再75°C水浴15min终止反应，_80°C保存。
5.如权利要求2所述水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤OsICEl基因cDNA全长的获得方法用AtICEl基因(AT3G26744.1)序列在NCBI核酸数据库中搜索水稻同源基因，获得与 AtICEl相似性为57%的水稻基因序列(编号为0sllg052370)，依据该同源基因0sllg052370 的序列设计引物，用上述获得的水稻材料日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，引物序列为OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’该PCR引物所扩增的区段包含完整的OsICEl阅读框；PCR反应程序如下94°C预变性4min，98°C变性10s，60°C复性延伸2min，35个循环后，72°C IOmin ;扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带切割，用凝胶回收试剂盒进行产物回收；PCR产物回收后用 PUCm-T载体连接；取5 μ I连接产物加入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，冰浴10_20min， 42°C热激90秒，冰浴10分钟，加入500 μ I LB液体培养基，37°C摇床上低速摇菌I小时；取` 100 μ I菌液均匀涂于含有100 μ gmL—1安苄的LB固体培养基上生长12h_14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsICEl基因的cDNA序列与NCBI NM_001074519序列完全相同；获得含有目的基因OsICEl cDNA全长序列的重组质粒，命名为pICEl。
6.如权利要求2所述水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤表达载体pUb1-1CEl的构建方法根据水稻OsICEl基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICEl阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上获得的PlCEl质粒为模板，PCR程序如下941预变性41^11，981变性10s，60°C 复性延伸2min，35个循环后，72°C IOmin,扩增的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶BamHI进行单酶切，同时用BamH I单酶切表达载体质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在 4°C下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μ gmL—1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经BamHI酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30%甘油于_70°C保存，提取阳性克隆质粒命名为pUb1-1CEl;最后通过电击法将pUb1-1CEl质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50 μ gmL-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于_70°C保存，转基因备用。
7.如权利要求2所述水稻OsICEl基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤转基因植株的获得方法侵染愈伤组织和共培养取水稻材料日本晴花后15 d的幼胚，用75 %乙醇浸泡I min，再用25 %的次氯酸钠浸泡25-30 min,无菌水洗3 -4次，用异物针挑出幼胚，接种于诱导培养基上；将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液Iml于1. 5ml离心管中，4°C, 5000rpm,离心I min,去上清,用含200 μ moll/1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上浙干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25°C暗培养 60h;洗菌和抗生素筛选培养将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无茵水清5次，每次不停的振荡5min,再用含SOOmgI/1羧节青霉素car的无茵水浸泡40_60min,最后置于无菌滤纸上浙干2h，第一轮筛选将晾干的愈伤组织转入含25011^171羧苄青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的选择培养基上进行第一次选择，30°C，光照培养14d ;第二轮筛选将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含25011^171羧苄青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的选择培养基上，300C，光照培养IOd然后转移到组培室中培养4d;抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入分化培养基中，放入恒温培养室，组培室培养条件为24-30°C，14h光/8h暗，待苗长至5cm，放入生根培养基中壮苗；剪取待检测苗Icm长的新鲜绿色叶片，平放于含潮霉素SOrngL—1培养基上，30°C， 16h/8h光/暗培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死，通过潮霉素筛选得到阳性TO植株；TO代种子发芽后得到Tl代转基因苗，提取转基因Tl代苗不同株系叶片的总 RNA,反转录总 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’ -GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’进行半定量PCR鉴定，结果具有727bp条带的，即为得到的稳定遗传的转基因株系；同时，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物进行PCR检测。
8.—种OsICEl转基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，其特征在于，首先，从转基因水稻植株冷胁迫表型方面观察OsICEl基因对冷胁迫的抗性表现；模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6°C下培养四天，观察到转基因植株C1-T12，C2-T25， C3-T7，C4-T5的长势优于对照植株，表现在植株高度、叶色和根长等性状；同样条件下，转基因植株C5-T21为OsICEl基因的反义表达载体转化的植株，其植株幼苗在6°C冷胁迫条件下培养，对冷胁迫反应较敏感。
全文摘要
本发明公开了一种水稻OsICE1基因的双元载体及其应用，该双元载体包括Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS, Pubi:ICE1-MYC:NOS与ICE1-antisense载体。该应用方法把构建的OsICE1基因的五种表达载体Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS，Pubi:ICE1-MYC:NOS和ICE1-antisense转入水稻受体材料日本晴中，经繁殖传代，获得T2代转基因植株。此外，本发明还对OsICE1转基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，得到的转基因植株C5-T21为OsICE1基因的反义表达载体转化的植株，其植株幼苗在6℃冷胁迫条件下培养，对冷胁迫反应较敏感。本发明提供的功能基因的双元载体的构建及转基因技术在植物的抗逆性分子育种中具有较广泛的实践意义和广阔的应用前景。
文档编号C12N15/66GK103014062SQ20131000934
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者杨立明, 罗玉明, 季勤, 胡向阳, 刘华清, 田大刚 申请人:淮阴师范学院