人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，涉及中药材的鉴别方法，具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法。本发明提供了能够特异性识别人参与西洋参的DNA分子标记，所述的DNA分子标记分别位于Seq.No.1～5的DNA序列中的（SSR）位点上，根据上述序列设计5对引物，对人参和西洋参的DNA模板进行PCR扩增，每一对引物都能分别扩增出特异性识别人参和西洋参的PCR产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测这些长度不一的产物，从而快速鉴别人参与西洋参。本方法所需样品少，不受产品形态的限制，对样品的DNA长度要求不高，PCR稳定且重复性好。
【专利说明】人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，涉及中药材的鉴别方法。具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法。
【背景技术】
[0002]人参(Panaxginseng C.A.Meyer)和西洋参(Panax quinquefolius L.)均为目前我国应用最广泛的重要中药材，属多年生宿根草本植物五加科(Araliaceae)人参。研究显示，人参分布于我国东北、俄罗斯远东地区及朝鲜等地；西洋参原产于北美低山地区，我国引种成功后在东北、华北、华中和康滇四大栽培区均有栽种。现有技术公开了人参和西洋参药性差异较大，但形态相似，尤其是国内栽培的人参与栽培西洋参很难根据形态特征准确鉴别，两者的粉末更是难以区别。因此市场需求一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西洋参的方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目 的在于提供重要中药材的鉴别方法，具体涉及人参与西洋参的特异性分子标记，及其鉴别方法，尤其是一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西洋参的方法。
[0004]本发明提供了能够特异性识别人参与西洋参的DNA分子标记，所述的DNA分子标记分别位于Seq.N0.1~5的DNA序列中的(SSR)位点上,所述的Seq.N0.1, Seq.N0.2, Seq.N0.3，Seq.N0.4和Seq.N0.5DNA序列上分别具有一个简单重复序列(SSR)位点，通过该序列位点能够特异性地识别人参和西洋参；
[0005]进一步，本发明提供了基于上述DNA分子标记的快速鉴别人参与西洋参的方法，其中，根据上述序列设计5对引物，对人参和西洋参的DNA模板进行PCR扩增，每一对引物都能分别扩增出特异性识别人参和西洋参的PCR产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测这些长度不一的产物，从而快速鉴别人参与西洋参。
[0006]更具体的，本发明的快速鉴别人参与西洋参的方法，其特征在于，其包括，
[0007]1，特异性扩增人参与西洋参的简单重复序列(simple repeat sequence,简称SSR)位点的引物序列；本发明从大量含有SSR位点的人参序列中筛选出含有SSR位点的5条 DNA 序列，分别为 Seq.N0.1，Seq.N0.2，Seq.N0.3，Seq.N0.4 和 Seq.N0.5，这些 SSR 位点用于特异性地区别人参与西洋参；
[0008]2，利用上述的引物鉴别人参与西洋参:
[0009]根据上述5条人参DNA序列，设计5对多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,简称 PCR)引物，其序列分别为 Seq.N0.6 和 Seq.N0.7, Seq.N0.8 和 Seq.N0.9，Seq.N0.10 和 Seq.N0.11，Seq.N0.12 和 Seq.N0.13，Seq.N0.14 和 Seq.N0.15 ；
[0010]用Seq.N0.6+Seq.N0.7对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，PCR退火温度52°C，结果显示，人参能产生181bp长的PCR产物，而西洋参不能产生PCR产物；
[0011]用Seq.N0.8+Se q.N0.9对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度55°C，结果显示，人参只能产生一条203bp长的PCR产物，而西洋参则能产生191bp和203bp长的两条PCR产物；
[0012]用Seq.N0.10+Seq.N0.11对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57°C，结果显示，人参能产生一条243bp长的PCR产物，而西洋参则产生235bp长的PCR产物；
[0013]用Seq.N0.12+Seq.N0.13对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57°C，结果显示，人参只能产生一条184bp长的PCR产物，而西洋参则能产生166bp和157bp长的两条PCR产物；
[0014]用Seq.N0.14+Seq.N0.15对人参与西洋参的DNA模板分别进行PCR扩增，退火温度57°C，结果显示，人参能产生251bp和273bp两条PCR产物，而西洋参则不能产生PCR产物。
[0015]本发明的实施例中，对人参与西洋参进行鉴定:
[0016]I)取待鉴定样品0.05克，用高盐低PH法提取样品的总DNA ；
[0017]2)取25~50ng待检样品的DNA，从上述的5对引物中任选3对，按
[0018]各对引物特定的退火温度进行PCR扩增，每一对引物设置3次重复和空白对照；
[0019]3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检验PCR产物的大小；
[0020]4)根据所选引物对产生的PCR产物的大小和表1所提出的标准，对样品的属性做出判断。
[0021]本发明的上述鉴定中，
[0022]选择引物对(Seq.N0.6+Seq.N0.7)、引物对(Seq.N0.14+Seq.N0.15)和其它任何一个引物对进行PCR扩增，可以用琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果显示，采用前两个引物对扩增西洋参的DNA，不能获得任何产物，而扩增人参的DNA，将获得表1所示的产物；用其它3对引物分别扩增人参和西洋参的DNA均将获得如表1所示的大小不一的产物；
[0023]表1.用于人参、西洋参鉴定的5对PCR引物及产物大小
【权利要求】
1.含有人参与西洋参的特异性分子标记位点的如Seq.N0.1，Seq.N0.2，Seq.N0.3，Seq.N0.4 和 Seq.N0.5 所不的 DNA 序列。
2.基于权利要求1所述的DNA序列的PCR引物对，其序列组合为:Seq.N0.6和Seq.N0.7，Seq.N0.8 和 Seq.N0.9，Seq.N0.10 和 Seq.N0.11，Seq.N0.12 和 Seq.N0.13，Seq.N0.14和 Seq.N0.15。
3.一种鉴别人参与西洋参的方法，其特征在于，包括:特异性扩增人参与西洋参的简单重复序列位点的如权利要求2所述的引物序列，利用所述的引物鉴别人参与西洋参，其包括步骤: 1)取待鉴定样品，用高盐低PH法提取样品的总DNA； 2)取待检样品的DNA，从所述的引物对中任选其中3对，按各对引物特定的 退火温度进行PCR扩增，每一对引物设置3次重复和空白对照； 3)根据所选引物对扩增的PCR产物大小对样品的属性做出判断。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述各引物对的判断标准如表1所示: 表1.用于人参、西洋参鉴定的5对PCR引物及产物大小
【文档编号】C12N15/11GK103923909SQ201310014700
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月15日 优先权日:2013年1月15日
【发明者】张文驹, 陈子易, 程舟, 陈家宽 申请人:复旦大学