一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法
【专利摘要】本发明提供一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，包括以下几个步骤：A、配制氨氧化菌群富集培养基；B、氨氧化菌群的富集培养：将含有氨氧化古细菌的生物膜或活性污泥接种于富集培养基中；C、配制氨氧化古细菌的富集培养基：氨氧化菌群的富集培养基中添加抗生素；D、氨氧化古细菌的富集培养：用过滤器将富集培养液过滤后转接到步骤C中的氨氧化古细菌富集培养基中，得到纯度较高的氨氧化古细菌的富集培养液。纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液为氨氧化古细菌生理生化特性的研究提供了可能，氨氧化古细菌具有较强的耐性，若将氨氧化古细菌引入到氨氧化强化技术之中，将对提高污水处理生物脱氮能力具有重要的现实意义。
【专利说明】一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物领域，具体地说是一种处理废水中氨氮的氨氧化古细菌的富集培养方法。
【背景技术】
[0002]生物脱氮技术是水环境保护中最为重要、最为常用的技术之一，硝化过程中的氨氧化步骤是生物脱氮技术的关键步骤和限速步骤。长期以来的研究一直认为参与这一过程的主要微生物为氨氧化细菌，但是近年研究发现一种古菌也具有氨氧化功能，被称作氨氧化古细菌。尽管在污水处理系统中，氨氧化细菌在氨氧化过程中担当着重要角色，它进行生物脱氮也有一定的缺陷。首先是氨氧化细菌数量很少，通常仅占细菌总量的0.1%，在城市污水系统中更是低于0.01% ;其次是生长缓慢，世代时间较长，实验室培养、驯化难度较高:再有就是受生态因子影响较大，很难在高温、低溶解氧等环境下生长。
[0003]而对于氨氧化古细菌，研究表明，在生态环境中，氨氧化古细菌分布广泛，数量庞大，部分氨氧化古细菌可以广泛生存于低溶氧、高温、嗜酸/碱等极端环境中，这为在极端环境条件下进行污水处理提供了可能。
[0004]已有技术描述:传统的倍比稀释平板划线等富集筛选细菌的方法对氨氧化古细菌并不适用。传统的对污水处理系统中的氨氧化古细菌的富集方法只是采用生活污水或人工配水在实验装置中进行，富集达到检测线后，主要用来分析氨氧化古细菌的种群结构。
[0005]在传统的利用生活污水或人工配水富集培养氨氧化古细菌的方法中，在富集培养系统中会有大量的异养菌，氨氧化古细菌在系统中的所占比重非常小，很难获得纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，包括以下几个步骤:
A、配制氨氧化菌群富集培养基；
B、氨氧化菌群的富集培养:将含有氨氧化古细菌生物膜或活性污泥接种于富集培养基
中；
C、配制氨氧化古细菌的富集培养基:氨氧化菌群的富集培养基中添加抗生素；
D、氨氧化古细菌的富集培养方法:用过滤器将富集培养液过滤后将滤液转接到步骤C中的氨氧化古细菌富集培养基中，得到纯度较高的氨氧化古细菌的富集培养液。
[0007]本发明采用以上技术方案，其优点在于，过滤器过滤富集培养液和在培养基中添加抗生素来富集培养氨氧化古细菌，可去除氨氧化古细菌富集培养液中大量的杂菌，获得纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
[0008]优选的，所述步骤A中，富集培养基包括:NaCl、MgCl2.6H20、KCl、CaCl2、KBr、KH2PO4。[0009]优选的，所述步骤A 中，NaCl、MgCl2.6H20、KCl、CaCl2、KBr 和 KH2PO4 的质量比为 10:4:5:1:1:2o
[0010]优选的，所述步骤A中，富集培养基的配制方法包括:将富集培养基中的溶液在121°C下灭菌30min，然后加入用0.2 μ m滤膜过滤后的NH4Cl溶液、NaHCO3溶液、EDTA Na-Fe溶液、丙酮酸钠溶液、微量元素、维生素和硒钨溶液。
[0011]优选的，所述步骤A中，微量元素配制方法:1.5g FeCl2.4H20先溶于IOmL HC1，然后加入 CoCl2.6H20:190mg, MnCl2.6H20:IOOmg, ZnCl2:70mg, HBO3:62mg, Na2MoO4.2H20:36mg, NiCl2.6H20:24mg, CuCl2.2H20:17mg，加水定容至 IOOOmL0
[0012]优选的，所述步骤A中，维生素配方为:4_氨基苯甲酸:40mg，D-生物素:10mg，烟酸:IOOmg, I1D-泛酸|丐:50mg,吡卩多醇盐酸盐:150mg,水IOOOmL, IOmM磷酸钠缓冲溶液调pH值为7.1。
[0013]优选的，所述步骤A中，硒钨溶液配方包括:NaOH:0.4g，Na2SeO3* 5H20:6mg,Na2WO4.2H20:8mg,水 lOOOmL。
[0014]优选的，所述步骤B中，pH值为7.2-7.5，在温度为37±1°C的培养箱中静置培养。
[0015]优选的，所述步骤C中，青霉素、链霉素和氨苄青霉素的添加浓度均为50mg/L。
[0016]本发明进一步采用以上技术方案，其优点在于，所加的三种抗生素的浓度都为50mg/L,可以抑制一些细菌的生长，但对氨氧化古细菌的生长没有抑制作用。
[0017]优选的，所述步骤D中，过滤器采用0.45 μ m膜针头式过滤器。
[0018]优选的，所述的富集培养液中NH4+-N的浓度始终保持在ImM以下。
[0019]优选的，所述步骤D中，调节pH值为7.2-7.5，在温度为37土1°C的培养箱中静置培养。
[0020]优选的，所述步骤B中，培养时间以14-16天为一代培养周期，黑暗的环境中培养2个周期，并隔2-3天补充NH4Cl和NaHC03。
[0021]优选的，所述步骤D中，黑暗的环境中培养3个周期，并隔3-5天补充NH4Cl和NaHC03。可得到纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
[0022]本发明的有益效果是:纯度较高的氨氧化富集培养液为氨氧化古细菌生理生化特性的研究提供了可能，氨氧化古细菌具有较强的耐性，若将氨氧化古细菌引入到氨氧化强化技术之中，将对提高污水处理生物脱氮能力具有重要的现实意义。如利用其适应低溶氧环境的特性，将其应用于污水脱氮处理可节省水厂的部分动力消耗；利用其在低氨氮条件下具有较强竞争力的特性，将其应用于低浓度氨氮废水的脱氮处理中，可提高此类废水的脱氮效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1氨氧化古细菌amoA基因拷贝数的标准曲线 图2氨氧化细菌amoA基因拷贝数的标准曲线
图3细菌拷贝数的标准曲线 图4古菌拷贝数的标准曲线
【具体实施方式】[0024]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明:
实施例1
氨氧化菌群的富集培养方法
(I)氨氧化菌群富集培养基的配制:NaCl lg, MgCl2.6H20 0.4g, KCl 0.5g, CaCl20.lg,KBr 0.1g7KH2PO4 0.2g，水 lOOOmL。121°C下灭菌 30min，然后加入用 0.2 μ m 滤膜过滤后的 NH4Cl (1M): ImL, NaHCO3 溶液(1M):2mL, EDTA Na-Fe 溶液:ImL,丙酮酸钠溶液(1M):ImL,微量元素:ImL,维生素:ImL,硒鹤溶液:lmL。
[0025](2)氨氧化菌群的富集培养:将含有氨氧化古细菌生物膜或活性污泥接种于富集培养基中，调节pH值为7.2-7.5，在温度为37± I °C的培养箱中静置培养，培养时间以14-16天为一代培养周期，黑暗的环境中培养2个周期，并隔2-3天补充ImLNH4Cl溶液和2mLNaHC03 溶液。
[0026]氨氧化古细菌的纯化富集培养方法
(3)氨氧化古细菌的富集培养基配制:氨氧化菌群的富集培养基中添加青霉素:50mg/L,链霉素:50mg/L,氨节青霉素:50mg/L。
[0027](4)氨氧化古细菌的富集培养方法:选用0.45 μ m膜针头式过滤器过滤氨氧化菌群富集培养液然后将滤液接种于氨氧化古细菌培养基中。调节PH值为7.2-7.5，在温度为37± I°C的培养箱中静置培养，黑暗的环境中培养3个周期，并隔3-5天补充0.5mLNH4Cl溶液和ImLNaHCO3溶液。可得到 纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
[0028]实施例2
氨氧化菌群的富集培养方法
(I)富集培养基的配制:NaCl 2g，MgCl2.6H20 0.8g, KCl lg, CaCl2 0.2g, KBr 0.2g,KH2PO4 0.4g，水2000mL。121°C下灭菌30min，然后加入用0.2 μ m滤膜过滤后的NH4CK 1M):2mL，NaHCO3溶液(IM):4mL，EDTA Na-Fe 溶液:2mL，丙酮酸钠溶液(lM):2mL，微量元素:2mL，维生素:2mL，硒钨溶液:2mL。
[0029](2)氨氧化菌群的富集培养:将含有氨氧化古细菌生物膜或活性污泥接种于富集培养基中，调节pH值为7.2-7.5，在温度为37± I °C的培养箱中静置培养，培养时间以14-16天为一代培养周期，黑暗的环境中培养2个周期，并隔2-3天补充2mLNH4Cl溶液和4mLNaHC03 溶液。
[0030]氨氧化古细菌的纯化富集培养方法
(3)氨氧化古细菌的富集培养基配制:氨氧化菌群的富集培养基中添加青霉素:50mg/L,链霉素:50mg/L,氨节青霉素:50mg/L。
[0031](4)氨氧化古细菌的富集培养方法:选用0.45 μ m膜针头式过滤器过滤氨氧化菌群富集培养液然后将滤液接种于氨氧化古细菌培养基中。调节PH值为7.2-7.5，在温度为37± I°C的培养箱中静置培养，黑暗的环境中培养3个周期，并隔3-5天补充ImLNH4Cl溶液和2mLNaHC03溶液。可得到纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
[0032]实施例3
氨氧化菌群的富集培养方法
(I)富集培养基的配制:NaCl 5g，MgCl2.6H20 2g，KCl 2.5g, CaCl2 0.5g, KBr 0.5g,KH2PO4 lg，水5000mL。121°C下灭菌30min，然后加入用0.2 μ m滤膜过滤后的NH4Cl (1M):5mL，NaHCO3 溶液(IM):10mL, EDTA Na-Fe 溶液:5mL，丙酮酸钠溶液(1M):5mL，微量元素:5mL，维生素:5mL，硒钨溶液:5mL。
[0033](2)氨氧化菌群的富集培养:将含有氨氧化古细菌的生物膜或活性污泥接种于富集培养基中，调节pH值为7.2-7.5，在温度为37土 TC的培养箱中静置培养，培养时间以14-16天为一代培养周期，黑暗的环境中培养2代培养周期，并隔2-3天补充5mL NH4Cl溶液和IOmL NaHCO3溶液。
[0034]氨氧化古细菌的纯化富集培养方法
(3)氨氧化古细菌的富集培养基配制:氨氧化菌群的富集培养基中添加青霉素:50mg/L,链霉素:50mg/L,氨节青霉素:50mg/L。
[0035](4)氨氧化古细菌的富集培养方法:选用0.45 μ m膜针头式过滤器过滤氨氧化菌群富集培养液然后将滤液接种于氨氧化古细菌培养基中。调节PH值为7.2-7.5，在温度为37土 TC的培养箱中静置培养，黑暗的环境中培养3代培养周期，并隔3-5天补充
2.5mLNH4Cl溶液和5mLNaHC03溶液。可得到纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
[0036]实验的主要检测方法是实时荧光定量PCR，所采用的引物如下表I所示，所做的标准曲线见图1-4。氨氧化细菌的标准曲线见图1，检测线为IO4 copies/L ;Α0Β标准曲线见图2，检测线为10 copies/L ;细菌的标准曲线见图3，检测线为IO4 copies/L ;古菌的标准曲线见图4，检测线为IO5 copies/PL。
[0037](I)反应体系:PCR反应体系为20μ?，反应体系如下dOpLSYBR Premix Ex Taq?II，2PL样品，上游引物和下游引物各0.4μ?，其余以无菌RNase-free水补足。
[0038](2)反应条件:首先95°C热启动30s，然后进行如下40个循环:95°C变性5s，53°C(古菌)/55°C (氨氧化古细菌、氨氧化细菌)/60°C (细菌)退火30s，72°C延伸lmin，72°C读取荧光值。
[0039](3)特异性检测:PCR反应结束后立即在65_95°C之间测定溶解曲线，并对反应产物也进行电泳检测。Tm值在80°C以上且溶解曲线为单峰时表明测定结果准确。
[0040]所得的富集培养液中，氨氧化细菌实时荧光定量PCR测得的循环数(CT值)已超过标准曲线的最大循环数，氨氧化细菌的数量已低于检测线，对氨氧化细菌实时荧光定量PCR的样品进行电泳实验，未发现亮条带，说明样品中已无氨氧化细菌的存在。氨氧化古细菌的数量由最初的低于IO4 copies/mL，不到总菌数的0.01%，富集培养后数量达到IO7 copies/mL以上，占总菌数的17%左右，至少增加了 3个数量级，富集效果显著。实施例1-3富集培养后的菌群数量见表2。
[0041]表I PCR扩增引物信息
【权利要求】
1.一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，包括以下几个步骤: A、配制氨氧化菌群富集培养基； B、氨氧化菌群的富集培养:将含有氨氧化古细菌的生物膜或活性污泥接种于富集培养基中； C、配制氨氧化古细菌的富集培养基:氨氧化菌群的富集培养基中添加抗生素； D、氨氧化古细菌的富集培养:用过滤器将富集培养液过滤后将滤液转接到步骤C中的氨氧化古细菌富集培养基中，得到纯度高的氨氧化古细菌的富集培养液。
2.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤 A 中，富集培养基包括:NaCl 'MgCl2.6H20、KCl、CaCl2、KBr、KH2PO4, NaCl、MgCl2.6H20、KC1、CaCl2、KBr 和 KH2PO4 的质量比为 10:4:5:1:1:2。
3.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤A中，富集培养基的配制方法包括:将富集培养基中的溶液在121 °C下灭菌30min，然后加入用0.2 μ m滤膜过滤后的NH4Cl溶液、NaHCO3溶液、EDTA Na-Fe溶液、丙酮酸钠溶液、微量元素、维生素和硒钨溶液。
4.如权利要求3所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所属步骤A中，微量元素配制方法:1.5g FeCl2.4H20先溶于IOmL HCl，然后加入CoCl2.6H20: 190mg, MnCl2.6H20:IOOmg, ZnCl2:70mg, HBO3:62mg, Na2MoO4.2H20:36mg, NiCl2.6H20:24mg, CuCl2.2H20:17mg，加水定容至 IOOOmL ； 维生素配方为:4-氨基苯 甲酸:40mg, D-生物素:10mg,烟酸:100mg, |丐D-泛酸隹丐:50mg，吡哆醇盐酸盐:150mg，水IOOOmL,再用IOmM磷酸钠缓冲溶液调pH值为7.1 ；
硒钨溶液配方:NaOH:0.4g, Na2SeO3.5H20:6mg, Na2WO4.2H20:8mg，水 lOOOmL。
5.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤B中，pH值为7.2-7.5，在温度为37± I°C的培养箱中静置培养。
6.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述抗生素包括青霉素、链霉素和氨苄青霉素，青霉素、链霉素和氨苄青霉素的添加浓度均为50mg/L。
7.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤D中，过滤器采用0.45 μ m膜针头式过滤器。
8.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤D中，调节pH值为7.2-7.5，在温度为37± 1°C的培养箱中静置培养。
9.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤B中，培养时间以14-16天为一代培养周期，黑暗的环境中培养2个周期，并隔2-3天补充NH4Cl和NaHCO3。
10.如权利要求1所述的污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法，其特征在于，所述步骤D中，黑暗的环境中培养3个周期，并隔3-5天补充NH4Cl和NaHCO3,得到纯度较高的氨氧化古细菌富集培养液。
【文档编号】C12N1/20GK103451120SQ201310041633
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2013年2月4日
【发明者】金文标, 李志鑫, 岳洋洋, 梁昭云 申请人:哈尔滨工业大学深圳研究生院