新的短核苷酸串联重复序列位点及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的短核苷酸串联重复序列位点及其应用，短串联重复序列基因座G2S0002，序列如SEQ?ID?NO.:1所示，用于制备(a)用于遗传关系分析的试剂或试剂盒；(b)用于个体识别的试剂或试剂盒；(c)用于亲子鉴定或血缘分析的试剂或试剂盒；(d)用于检测抽提羊水中是否存在母血污染的试剂或试剂盒；和/或(e)用于检测骨髓移植后受体中的白细胞是否被供体细胞取代的试剂盒。短串联重复序列基因座G2S0002区分度高，能够有效地分析遗传关系。
【专利说明】新的短核苷酸串联重复序列位点及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种短核苷酸串联重复序列位点及其应用。
【背景技术】
[0002]短串联重复序列(ShortTandem Repeat.STR),又称微卫星 DNA (microsatelliteDNA)，是一类重复单位2-6bp，重复次数10-60，片段长度在400bp以下的DNA串联重复序列；其产生原因是DNA复制过程中滑动，或在复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的缺失或插入。STR具有在基因组中分布广泛、等位基因多、杂合度高、分型结果稳定，STR遗传符合孟得尔遗传定律(Koreth, J.，et al.1996.Microsatellitesand PCR ge-nomic analysis.J.Pathol.178:239-248.)等特点，并且多个 STR 基因座联合检测时，个体识别力和非父排除率高。因而STR以其遗传多态性等特征，已被作为第二代遗传标记广泛应用于医学个体识别、人类遗传图谱绘制、亲子鉴定、法医物证检验等领域，有效地推动了法医鉴定学从以往物证样本的个体排除向个体识别全面转换。
[0003]目前，个体识别的技术主要采用STR-PCR检测，对多个STR基因座联合分型，以确定未权关系或个体识别等，在实验方法都相对成熟，但在STR基因座的选择上，没有统一标准。国内外生产商提供的检测试剂盒中所用的位点不尽相同。早期欧美选用10个STR基因座加 I 个性别决定基因(E.A.Cotton, R.F.Allsop, J.F.Guest, R.R.E.Frazier, P.Koumi, 1.P.Callow, A.Seager, R.L.Sparkes, Validation of the AmpF I STR" SGM Plus? systemfor use in forensic casework, Forensic Sc1.1nt.112 (2000) 151 - 161.)。后来随着技术发展、数据库增多，比对信息难度加大，STR基因座的选择也在不断改进。现在比较有影响力的数据库CODIS (Combined DNA Index System)是由美国FBI基于13个STR基因座(D3S1358,vffA,D16S539,D5S818,D7S820,CSF1P0,D13S317,TPOX,D8S1179,D21S11,D18S51,THO I, FGA.)构建，因而现在大多数STR检测试剂盒生产商也在这13个核心基因座的基础上增加或删减一些位点以提高检测效率及准确率(D.J.French, R.L.Howard, N.Gale, T.Brown, D.G.McDowell, P.G.Debenhan, Interrogation of short tandem repeats usingfluorescent probes and melting curve analysis:A step towards rapid DNA identityscreening.Forensic Science.(2008)333-339)。例如 Promega 公司的 PowerPlex"16System试剂盒包括了 13个核心基因座，并增加了 PentaD、PentaE和AMELO三个基因座；美国 ABI 公司的AmpF/STR* Identif iler* PCRAmplification Kit 则是 13 个核心基因座加上D2S1338、D19S433和AMELO ;其公司的另外两款试剂盒AmpFlSTRf SGM Plus? PCRAmplification Kit 和AmpFlSTR* Sinofiler" PCR Amplification Kit 也做了相应基因座位点的增减。国内生产类似检测试剂盒的单位也有很多，例如公安部二所推广的DNATyper?15,中德美联生物技术有限公司的AG⑶EX22STR荧光检测试剂盒，所检测基因座增至22个。
[0004]以上试剂盒选择的STR基因座的优点在于，以13个得到公认的核心基因座为基础，附加一些其它位点以丰富所检测得到的信息量，能较全面的反应出个体间的差异性，进而完成个体识别、父权判定等工作。但是所用的这些基因座中并非都是最优选择，例如FGA基因座存在序列长度过长、重复单元多但跨度不连续，从而影响了与其它位点的兼容性，不利于与多个基因座联合检测的多重体系运用；D19S433基因座则位于基因组中高度重复序列区，扩增引物设计存在较大麻烦，并且该位点的稳定性不高，应用于个体识别时所提供的可用信息质量和区分度都不高；再如D21S11基因座除了存在位于基因组中高度重复序列区域的问题之外，还发现在该基因座所在区域中可能存在CNV(基因拷贝数变异的情况；在遇到基因拷贝数非正常的样本检测时，会降低该位点STR分型的准确度，在个人识别中采用该基因座的 效果也会大打折扣。随着人类基因组图谱的建立及测序技术的发展，以较低的成本，在较快的时间内对个人全基因组重测序成为可能，进而能在较大的信息量下筛选出区分度更高的STR基因座，推动了应用于个体识别等研究中的STR基因座的选择与更新。
[0005]因此，为克服兼容性差、存在CNV或位于高度重复序列区域等缺陷，本领域尚需一种新型的具有高区分度的短串联重复序列。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新型的短串联重复序列基因座，不存在CNV，且不位于高度重复序列区域，具有高区分度。
[0007]本发明的第一方面，提供一种分离的短串联重复序列基因座G2S0002，序列如SEQID N0.:1 所示。
[0008]本发明的第二方面，提供一种分离的核苷酸序列，所述核苷酸序列的结构如下:
[0009]X1-X2-X3
[0010]式中，Xl为 SEQ ID N0.:2 中第 1-782 位；
[0011]X2为含有≥2个重复单元aaag的遗传多态区；
[0012]X3 为 SEQ ID N0.:2 中第 873-1652 位。
[0013]本发明的第三方面，提供第一方面所述的短串联重复序列基因座G2S0002的用途，用于制备:
[0014](a)用于遗传关系分析的试剂或试剂盒；
[0015](b)用于个体识别的试剂或试剂盒；
[0016](c)用于亲子鉴定或血缘分析的试剂或试剂盒；
[0017](d)用于检测抽提羊水中是否存在母血污染的试剂或试剂盒；和/或
[0018](e)用于检测骨髓移植后受体中的白细胞是否被供体细胞取代的试剂盒。
[0019]在另一优选例中，所述的试剂包括(i)引物或引物对；(ii)探针；(iii)核酸芯片。
[0020]在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
[0021]本发明的第四方面，提供一种特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对，所述的引物对的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
[0022]在另一优选例中，所述短串联重复序列基因座G2S0002如第一方面所述。
[0023]本发明的第五方面，提供一种试剂盒，包括:
[0024](a)用于特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对；
[0025](b)使用说明书。[0026]在另一优选例中，所述短串联重复序列基因座G2S0002如第一方面所述。
[0027]在另一优选例中，所述试剂盒还包括(C)特异性扩增选自下组的一种或多种基因座的引物对:
[0028]D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSFlP0、D13S317、TP0X、D8S1179、D21Sll、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
[0029]本发明的第六方面，提供一种扩增体系，包括:
[0030](a)用于特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对；和
[0031](b)任选的、特异性扩增选自下组的一种或多种基因座的引物对:
[0032]D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSFlP0、D13S317、TP0X、D8S1179、D21Sll、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMELO ；
[0033]并且所述引物对(a)和任选的引物对(b)位于同一扩增体系。
[0034]在另一优选例中，所述短串联重复序列基因座G2S0002如第一方面所述。 [0035]在另一优选例中，所述的扩增体系为复合扩增体系，其中，所述的引物对(b)包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16对特异性引物对；和 / 或
[0036]所述复合扩增体系为荧光标记的复合扩增体系，其中，所述荧光标记是指选用下组的一种或多种荧光标记试剂标记所述基因座的引物:FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。
[0037]本发明的第七方面，提供一种扩增方法，包括步骤:
[0038]在第六方面所述的扩增体系中，以待检测样本为模板，利用聚合酶链式反应进行基因座的扩增，从而获得基因座扩增产物。
[0039]在另一优选例中，所述方法还包括:对所述基因座扩增产物进行检测的步骤。
[0040]在另一优选例中，所述的检测选自下组:毛细管电泳、测序、杂交。
[0041]在另一优选例中，所述待测样品选自下组:血液、唾液、精液、汗液、羊水、骨骼、或毛发。
[0042]本发明的第八方面，提供一种遗传关系分析方法，包括步骤:
[0043]在第六方面所述的扩增体系中，以待检测样本为模板，利用聚合酶链式反应进行基因座的扩增，从而获得基因座扩增产物；和
[0044]其中，所述待检测样本包括分别来自不同个体的核酸样本SI, S2,......,Si，式中i
为≥2的正整数；
[0045](2)对来自不同核酸样本SI，S2,……，Si的基因座扩增产物进行检测，从而获得对应于不同核酸样本的检测结果；
[0046](3)对步骤(2)获得的检测结果进行比较，从而确定不同个体之间的遗传关系。
[0047]在另一优选例中，所述遗传关系分析包括个体识别分析、亲子鉴定分析、血缘关系分析。
[0048]本发明提供了一种新型的STR基因座，不存在CNV，且不位于高度重复序列区域、杂合度高，分辨率高、兼容性高，能与已有的大多数位点在同一体系内使用，能够有效区分随机人群的遗传关系。
[0049]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1为父本多个STR位点的检测峰图。
[0051]图2为母本多个STR位点的检测峰图。
[0052]图3为子代多个STR位点的检测峰图。
[0053]图4为无亲缘关系样本多个STR位点的检测峰图。
【具体实施方式】
[0054]本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次筛选出一种新型的短串联重复序列基因座G2S0002，含有> 2个重复单元aaag的遗传多态区。该短串联重复序列基因座区分度达到0.9197以上，与少量常规的STR基因座联用，可有效区分遗传关系，区分度高达0.99以上。在此基础上，完成了本发明。
[0055]短串联重复序列基因座
[0056]本发明通过大量筛选，分离出一种新的短串联重复序列基因座，STR位点信息如表I所示。
[0057]表1STR的基本信息
[0058]
【权利要求】
1.一种分离的短串联重复序列基因座G2S0002，其特征在于，所述基因座的序列如SEQID N0.:1 所示。
2.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的结构如下:
X1-X2-X3
式中，Xl 为 SEQ ID N0.:2 中第 1-782 位； X2为含有≥2个重复单元aaag的遗传多态区；
X3 为 SEQ ID N0.:2 中第 873-1652 位。
3.如权利要求1所述的短串联重复序列基因座G2S0002的用途，其特征在于，用于制备: (a)用于遗传关系分析的试剂或试剂盒； (b)用于个体识别的试剂或试剂盒； (C)用于亲子鉴定或血缘分析的试剂或试剂盒； (d)用于检测抽提羊水中是否存在母血污染的试剂或试剂盒；和/或 (e)用于检测骨髓移植后受体中的白细胞是否被供体细胞取代的试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括(i)引物或引物对；(ii)探针；(iii)核酸芯片。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的引物对的序列如SEQIDN0.:3和SEQID N0.:4 所示。
6.一种特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对，其特征在于，所述的引物对的序列如SEQ ID N0.:3和SEQ ID N0.:4所示。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)用于特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对； (b)使用说明书。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括(c)特异性扩增选自下组的一种或多种基因座的引物对:
D3S1358、vffA, D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX, D8S1179、D21S11、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
9.一种扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包括: (a)用于特异性扩增短串联重复序列基因座G2S0002的引物对；和 (b)任选的、特异性扩增选自下组的一种或多种基因座的引物对:
D3S1358、vffA, D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX, D8S1179、D21S11、D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMELO ； 并且所述引物对(a)和任选的引物对(b)位于同一扩增体系。
10.如权利要求9所述的扩增体系，其特征在于，所述的扩增体系为复合扩增体系，其中，所述的引物对(b)包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16对特异性引物对；和/或 所述复合扩增体系为荧光标记的复合扩增体系，其中，所述荧光标记是指选用下组的一种或多种荧光标记试剂标记所述基因座的引物:FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA, ROX、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。
11.一种扩增方法，其特征在于，包括步骤: 在权利要求9-10中任一所述的扩增体系中，以待检测样本为模板，利用聚合酶链式反应进行基因座的扩增，从而获得基因座扩增产物。
12.—种遗传关系分析方法，其特征在于，包括步骤: (1)在权利要求9-10中任一所述的扩增体系中，以待检测样本为模板，利用聚合酶链式反应进行基因座的扩增，从而获得基因座扩增产物；和其中，所述待检测样本包括分别来自不同个体的核酸样本SI, S2,......，Si，式中i为≥2的正整数； (2)对来自不同核酸样本SI，S2,……，Si的基因座扩增产物进行检测，从而获得对应于不同核酸样本的检测结果； (3)对步骤(2)获得的检测结 果进行比较，从而确定不同个体之间的遗传关系。
【文档编号】C12N15/11GK103966207SQ201310041317
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2013年2月1日
【发明者】姜正文, 马瑞晓, 张希 申请人:天昊生物医药科技（苏州）有限公司