基于dna文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体，该方法包括：蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联；第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入靶蛋白磁珠复合物进行第一轮筛选；重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液进行第二至N轮筛选；合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势且具有高亲和性的DNA序列得所述核酸适配体。本发明利用低浓度作为筛选条件以筛选出在极低浓度下都能与靶蛋白结合的高亲和力的核酸适配体，大大降低了PCR条件对筛选过程的影响，显著缩短了筛选的时间，减少了筛选轮数，提高了筛选的成功率。
【专利说明】基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体。
【背景技术】
[0002]核酸适配体是指可与目标分子特异性结合的单链的寡核苷酸链分子(DNA或RNA), 一般小于IOOmer。与抗体相比，核酸适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但作用的靶分子范围更广，包括毒素免疫原性弱和不具有免疫原性的物质及能够识别单抗不能区分的相似物质，比抗体具有更高的特异性，亲和力更高。因其结构和性能的独特优越性，核酸适配体日益广泛地应用于生物医学基础研究、疾病诊治和药物研发。
[0003]通常,核酸适配体是通过指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment, SELEX),筛选得到的。指数级富集配体系统进化技术的基本途径是将包含大容量的随机寡核苷酸序列的DNA文库溶液与靶分子共同孵育，并通过各种分离途径将结合复合物与未结合序列分离、洗脱、获得与靶分子结合的序列并对这些序列进行聚合酶链式反应扩增，经分离为单链后，生成次级文库，再用于下轮筛选，如此数轮反复后，挑选出富集的适配体，并进行测序即获得特异性识别靶分子的寡核苷酸序列，即核酸适配体。大容量的分子文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，理论上可以针对任何靶分子筛选，得到其特异性识别的核酸适配体序列。
[0004]目前尚未建立针对任意靶标的标准筛选流程，亦不能保证凡筛选必有效。技术筛选过程复杂、筛选成功率受到众多影响因素制约。尤其是PCR条件对SELEX筛选过程具有明显的影响，一个差的PCR条件甚至导致筛选的完全失败。
[0005]为了得到高亲和性结合的核酸适体，在筛选的过程中，通常是通过逐步减少DNA文库与靶物质孵育的时间，增加洗涤次数和洗涤时间以及与增加对照物质的量及孵育时间来增强筛选压力。然而，DNA适配体与靶物质孵育时，DNA的浓度是影响两者之间的结合主要因素之一。但目前的SELEX技术，在每轮筛选后均采用PCR扩增，用较高浓度的DNA文库与靶物质孵育，未能利用调控浓度作为提高筛选压力的主要手段。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题在于，针对现有核酸适配体筛选方法每轮筛选后均采用PCR扩增导致技术筛选过程复杂、筛选成功率低的缺陷，提供一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:构造一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，包括以下步骤:
[0008]蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物；[0009]第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物；
[0010]重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则执行重复筛选步骤进行下一轮筛选；
[0011]合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列做为该蛋白的核酸适配体。
[0012]在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述靶蛋白为内皮糖蛋白，所述对照蛋白为牛血清蛋白。
[0013]在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述第一轮筛选步骤具体包括:
[0014]正筛步骤:取初始DNA文库溶液于95°C加热并置冰上迅速冷却，加入靶蛋白磁珠复合物，置于37°C摇床孵育1.5^2.5h，移去上清，用缓冲液洗涤三次；
[0015]文库洗脱步骤:加入无菌水后在95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，取上清； [0016]PCR扩增步骤:以该上清为模板DNA文库溶液，并将该模板DNA文库溶液扩增16~20个循环后，分离单链并脱盐处理，得到第一轮筛选产物。
[0017]在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述重复筛选步骤具体包括:
[0018]文库的预处理步骤:将前一轮筛选产物取稀释2~10倍后做为下一轮筛选的DNA文库溶液，在95°C加热并置冰上迅速冷却；
[0019]反筛步骤:取对照蛋白磁珠复合物3~IOug加入预处理得到的DNA文库溶液中，37°C摇床孵育30分钟~1.5小时，置磁力架上收集上清；
[0020]正筛步骤:将反筛得到的上清稀释，加入靶蛋白磁珠复合物3~10ug，37°C摇床孵育30分钟~1.5小时，移除上清，用缓冲液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠复合物；
[0021]文库洗脱步骤:在DNA靶蛋白磁珠复合物中加入无菌水，95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，收集上清；重复用无菌水洗涤，收集每次的上清混合得到该轮筛选产物。
[0022]本发明还相应提供了一种核酸适配体，采用如上所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法制备获得。
[0023]实施本发明的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体，具有以下有益效果:本发明利用低浓度作为筛选压力以筛选出在极低浓度下都能与靶蛋白结合的高亲和力的核酸适配体，大大降低了 PCR条件对筛选过程的影响，简化了整个筛选过程，显著缩短了筛选的时间，减少了筛选轮数，提高了筛选的成功率。
【专利附图】
【附图说明】[0024]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0025]图1为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法的流程图；
[0026]图2为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法的过程示意图；
[0027]图3A-3G为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中各轮筛选产物及上清中DNA经PCR后的电泳图；
[0028]图4A-4B为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中空白对照组的激光共聚焦实验明场和暗场图；
[0029]图5A-5F为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中牛血清蛋白对照组的激光共聚焦实验明场和暗场图；
[0030]图6A-6F为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中内皮糖蛋白实验组的激光共聚焦实验明场和暗场图；
[0031 ] 图7A-7G为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中选出的在文库中占优势的DNA序列及其模拟二级结构图；
[0032]图8A-8B为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，E-Al与蛋白结合情况的流式检测结果图。
【具体实施方式】
[0033]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0034]本发明主要通过将包含大容量的随机寡核苷酸序列的DNA文库溶液与靶蛋白共同孵育，并通过各种分离途径将结合复合物与未结合序列分离、洗脱、获得与靶蛋白结合的序列并对这些序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，经分离为单链后，生成次级文库，再用于下轮筛选。从第二轮开始，将前一轮文库稀释、使其浓度逐轮递减进行筛选，并不再进行PCR扩增，数轮反复后，将筛选产物进行克隆、测序，合成在文库中数量占优的DNA序列，经测Kd值考察后，获得特异性识别靶分子的寡核苷酸序列，即核酸适配体。
[0035]请参阅图1，为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法的流程图。如图1所示，该实施例提供的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法主要包括以下步骤:
[0036]首先，在步骤SlOl中，执行蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物。
[0037]随后，在步骤S102中，执行第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物。
[0038]随后，在步骤S103中，执行重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则执行重复筛选步骤进行下一轮筛选。[0039]最后，在步骤S104中，执行合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列作为该蛋白的核酸适配体。
[0040]本发明还相应提供了采用该方法值得的核酸适配体。
[0041]本发明利用调控浓度这一与DNA亲和力密切相关的因素，做为提高筛选压力的手段，筛选出了具有高亲和力的靶蛋白核酸适配体；本发明除了第一轮筛选需要使用PCR扩增外，其余轮筛选的PCR扩增均用于筛选产物的验证及克隆测序前的准备，而不作为下一轮筛选文库的扩增，因此显著降低了 PCR条件对筛选过程的影响，简化了整个筛选过程，大大缩短了筛选的时间，提高了筛选的成功率。
[0042]请参阅图2，为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法的过程示意图。在本实施例中，取革巴蛋白为内皮糖蛋白(Endogl in ),对照蛋白为牛血清蛋白(BSA)。【具体实施方式】如下:
[0043](1)文库与引物预处理步骤
[0044]使用无菌水将上、下游引物配置成50uM浓度，DNA文库用PBS溶解为50uM的溶液，均保存于20°C。并配 置文库终浓度为5nM的PCR溶液体系，设置温度梯度PCR优化该DNA文库的扩增温度，选择特异性扩增最明显且无杂带的温度作为后续步骤的PCR扩增最适温度。
[0045]( 2 )蛋白磁珠交联步骤
[0046]该步骤如图2中步骤S201所示，具体如下:
[0047]①取150~300 μ I的磁珠，用25mM的MES (2_吗啉乙磺酸)，其pH值为5.0洗涤两
次并弃上清。
[0048]②用MES配置终浓度为50mg/ml的EDC (二氯乙烷)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)。
[0049]③取EDC和NHS各75~150 μ I至清洗过的磁珠，充分混匀于室温摇床孵育30~45分钟，置磁力架上4分钟，去上清。用150-300μ I的MES清洗两次。磁珠已活化。
[0050]④分别取牛血清蛋白和内皮糖蛋白25ug加入活化的磁珠中，室温下置摇床孵育30~45分钟，弃上清。
[0051]⑤用50mM的Tris (三羟甲基氨基甲烷)，其pH值为7.4，清洗包被蛋白的磁珠共4次。最后用PBS (含0.02%NaN3) 125u广250ul重悬包被蛋白的磁珠至0.1~θ.5ug/ul。
[0052]( 3 )第一轮筛选步骤
[0053]该步骤如图2中步骤S202-S204所示，具体如下:
[0054]①正筛步骤:如图2中步骤S202所示，取适量初始DNA文库溶液于95°C加热并置冰上迅速冷却，加入用PBS洗涤过的内皮糖蛋白-磁珠复合物中。37°C摇床孵育1.5^2.5h，移去上清，用清洗缓冲液洗涤三次得DNA-内皮糖蛋白-磁珠复合物。
[0055]②文库洗脱步骤:如图2中步骤S203所示，在正筛步骤得到的DNA-内皮糖蛋白-磁珠复合物中加入500微升无菌水。95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，收集上清。
[0056]③PCR扩增步骤:如图2中步骤S204所示，以文库洗脱步骤中所得上清为模板DNA文库溶液，并将该模板DNA文库溶液扩增16~20个循环后，再分离单链并脱盐处理，得到第一轮筛选产物。[0057]④测量步骤:该步骤可以进一步测A值，计算第一轮筛选产物的物质的量。
[0058](4)重复筛选步骤即第二轮筛选~第N轮筛选
[0059]该步骤如图2中步骤S205-S206所示，具体如下:
[0060]①文库的预处理步骤:将前一轮筛选产物取1/2用作后续提及的检测，另外1/2作为下一轮筛选的DNA文库溶液，用结合缓冲液(Binding Buffer)稀释2~10倍后，95°C加热并置冰上迅速冷却，待用。
[0061]②反筛步骤:取牛血清蛋白-磁珠复合物3~10ug，用25(T500uL结合缓冲液洗涤两次，加入上述的文库，37°C摇床孵育30分钟~1.5小时(该时间随着筛选轮数的增加而延长)。置磁力架上收集上清。
[0062]③正筛步骤:将反筛步骤得到的上清加结合缓冲液稀释至lmL，加入用PBS洗涤过的内皮糖蛋白-磁珠复合物3~10ug中。37°C摇床孵育30分钟~1.5小时(该时间随着筛选轮数的增加而减少)，移取上清，标记为“第N轮正筛上清”，用清洗缓冲液洗涤三次，得DNA-内皮糖蛋白-磁珠复合物。
[0063]④文库洗脱步骤:如图2中步骤S206所示，在DNA-内皮糖蛋白_磁珠复合物中加入200微升无菌水。95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，收集上清。重复用无菌水洗涤磁珠，收集每次的上清混合在一起，共收集到500uf Iml的本轮筛选产物，即DNA文库。
[0064](5)检测文库与蛋白 结合情况
[0065]前述重复筛选步骤的筛选轮数以电泳或激光共聚焦的结果来定。一般情况下，做3^4轮筛选。
[0066]①PCR扩增和电泳。将各轮筛选的产物与上清作为模板，以相同循环数作PCR扩增，对比每一轮筛选产物与上清的DNA量，判断该轮筛选中能与内皮糖蛋白结合的DNA的量是否占据优势，是则满足了预设要求，否则继续下一轮筛选。
[0067]②激光共聚焦。将各轮筛选的产物进行PCR扩增(并用荧光标记引物)，分离为单链，与靶蛋白及对照蛋白孵育，采用激光共聚焦评价结合效果，根据预设要求判断是否需要进行下一轮筛选。
[0068](6)克隆、测序、合成DNA步骤。
[0069]该步骤如图2中步骤S207-S208所示，具体如下:
[0070]先对最终筛选产物进行如步骤S207所示的克隆，再进入如步骤S208所示的测序，分析测序结果，选择在文库中占优势的DNA序列进行合成，得所需的核酸适配体。
[0071](7)考察核酸适配体与靶蛋白的亲和力。
[0072]将前述(5)中合成的带有荧光标记的DNA以及将带荧光标记的无关序列各IOOnM与内皮糖蛋白孵育，利用流式细胞仪测荧光强度变化，并推算出kd值，确定该序列对于靶标的特异性识别能力，将能与靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列作为该蛋白的核酸适配体。核酸适配体对靶分子具有的高亲和性。本领域基础技术人员熟知与抗体相比，核酸适配体与小分子的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间；与生物大分子之间的平衡解离常数一般在纳摩和皮摩尔之间。因此，对于本发明采用的靶分子内皮糖蛋白为小分子，因此高亲和性是指DNA序列与该内皮糖蛋白的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间。
[0073]请参阅图3A-3G，分别为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中各轮筛选产物及上清中DNA经PCR后的电泳图。其中，图3A-3C分别为第二轮正筛产物，第二轮正筛上清和第二轮反筛产物的电泳图。图3D-3E分别为第三轮正筛产物和第三轮正筛上清的电泳图。图3F-3G分别为第四轮正筛产物和第四轮正筛上清的电泳图。各图中下方标示的数字代表PCR的循环数。如图可见，第二轮筛选后，正筛上清中DNA的量较正筛产物多，反筛产物与正筛产物量相似(见图3A、3B和3C)。随着筛选轮数的增加，正筛上清中的DNA逐渐减少，至第四轮，正筛产物较正筛上清中的DNA多(见图3F-3G)，且由于此轮中与内皮糖蛋白孵育时的DNA文库溶液的浓度已远小于1~30ηΜ。因此建议将第二轮、第三轮及第四轮的产物PCR扩增，用激光共聚焦进行表征以进行分析。
[0074]请参阅图4A-4B分别为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中空白对照组的激光共聚焦实验明场和暗场图。该空白对照组为用荧光标记的内皮糖蛋白-M270磁珠复合物。
[0075]图5A-5F分别为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中牛血清蛋白对照组的激光共聚焦实验明场和暗场图。该牛血清蛋白对照组为各轮筛选产物用荧光标记后分别与牛血清蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的结果。其中，图5A和5B分别为第二轮筛选产物与牛血清蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图；图5C和分别为第三轮筛选产物与牛血清蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图；图5E和5F分别为第四轮筛选产物与牛血清蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图。
[0076]图6A-6F分别为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中内皮糖蛋白实验组的激光共聚焦实验明场和暗场图。该内皮糖蛋白实验组为各轮筛选产物用荧光标记后分别与内皮糖蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的结果。其中，图6A和6B分别为第二轮筛选产物与内皮糖蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图；图6C和6D分别为第三轮筛选产物与内皮糖蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图；图6E和6F分别为第四轮筛选产物与内皮糖蛋白-M270磁珠复合物孵育后做激光共聚焦的明场和暗场图。
[0077]前述所有激光共聚焦实验的条件相同。从图中显示，内皮糖蛋白实验组在第三、四轮可见荧光。而牛血清蛋白对照组未见荧光，表明这两轮筛选产物与内皮糖蛋白结合明显较对照蛋白强，因此可以建议在第三轮筛选或者第四轮筛选后进行克隆测序。
[0078]请参阅图7A-7G，为根据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，从克隆、测序结果中选出在文库中占优势的DNA序列及其模拟二级结构图。克隆测序结果表明第二轮筛选产物测序，其中有3%为同一序列。第三轮筛选产物中，该序列达25%。第四轮筛选产物中，测序该序列达68%，称该序列为E-Al。其中，图7A为E-Al的克隆测序结果图；图7B-7G为E-Al的多种模拟二级结构图。
[0079]图8A-8B为根 据本发明的优选实施例的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，E-Al与蛋白结合情况的流式检测结果图。合成带荧光标记的E-A1，经文库与内皮糖蛋白孵育后用流式细胞仪测试荧光强度。其中图8A为流式细胞仪检测，对比无关序列和E-Al分别与内皮糖蛋白的孵育后荧光强度变化图。曲线Kl为空白对照，曲线K2为无关序列，曲线K3为E-A1。图SB为用流式测其荧光强度，计算平衡常数及行E-Al与内皮糖蛋白平衡解离常数的拟合；计算出E-Al的kd约为6.9nM±0.56，实验证明本发明筛选得到的E-Al与靶蛋白具有高的亲和性，可能作为内皮糖蛋白检测的分子探针。
[0080] 本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。
【权利要求】
1.一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: 蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物； 第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物； 重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则执行重复筛选步骤进行下一轮筛选； 合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列作为该蛋白的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述靶蛋白为内皮糖蛋白，所述对照蛋白为牛血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述第一轮筛选步骤具体包括: 正筛步骤:取初始DNA文库溶液于95°C加热并置冰上迅速冷却，加入靶蛋白磁珠复合物，置于37°C摇床孵育1.5^2.5h，移去上清，用缓冲液洗涤三次； 文库洗脱步骤:加入无菌水后在95°C加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，取上清； PCR扩增步骤:以该上清为模板DNA文库溶液，并将该模板DNA文库溶液扩增16~20个循环后，分离单链并脱盐处理，得到第一轮筛选产物。
4.根据权利要求3所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述重复筛选步骤具体包括: 文库的预处理步骤:将前一轮筛选产物取稀释2~10倍后做为下一轮筛选的DNA文库溶液，在95°C加热并置冰上迅速冷却； 反筛步骤:取对照蛋白磁珠复合物3~10ug加入预处理得到的DNA文库溶液中，37°C摇床孵育30分钟~1.5小时，置磁力架上收集上清； 正筛步骤:将反筛得到的上清稀释，加入靶蛋白磁珠复合物3~10ug，37°C摇床孵育30分钟~1.5小时，移除上清，用缓冲液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠复合物； 文库洗脱步骤:在DNA靶蛋白磁珠复合物中加入无菌水，95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3~5分钟，收集上清；重复用无菌水洗涤，收集每次的上清混合得到该轮筛选产物。
5.—种核酸适配体,其特征在于,米用根据权利要求1-4中任意一项所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法制备获得。
【文档编号】C12N15/10GK103966222SQ201310040069
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2013年2月1日
【发明者】赵永祥, 李霞, 卢小玲 申请人:广西医科大学