一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用。所述产油酵母脂滴蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ?ID?NO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相关活性的由SEQ?ID?NO：1衍生的蛋白质。绿色荧光蛋白共定位和油脂发酵分析证明，本发明的产油酵母脂滴蛋白及其编码基因能显著提高细胞油脂积累和贮存量。本发明还通过基因异源表达获得了可显著提高油脂积累量的重组工程菌株。本发明的产油酵母脂滴蛋白及其编码基因可应用微生物油脂、脂肪酸衍生物生产菌株构建，以及作为肥胖病人治疗药物筛选的靶标。
【专利说明】一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种产油酵母脂滴蛋白及其基因与应用。具体地，所述产油酵母脂滴蛋白以及编码其的核苷酸来源于禾本红酵母(R.graminis)。本发明还提供一种构建油脂生产重组细胞的方法。
【背景技术】 [0002]油脂是一种氧含量低、能量密度高、碳链长度适中的可再生资源，可以代替化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，是人类从碳氢经济向碳氢氧经济过渡的重要链接，其市场潜力巨大。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Rhodotorula, Candida,Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 属中的某些菌株[Ratledge C, WynnJ P.Adv Appl Microbiol2002,51,1-51]。利用微生物转化生物质资源生产油脂,可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，形成化学品的石化资源替代品生产新途径[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半个世纪以来，国内外微生物油脂研究的重点集中在菌株筛选、驯化和发酵工艺优化等领域，取得了重大进展。随着生物技术的快速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足产油微生物性状改良的需要。做为某一化学品的天然生产菌株，其特定的生产性能往往并非最优。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物【技术领域】研究的热点和难点。油脂发酵研究需要油脂代谢途径的重构和强化，赋予重组菌株生产新型脂肪酸衍生物的性能。由于优良土著生产菌株的遗传背景目前仍不清楚，油脂积累代谢调控相关基因克隆有限，寻找更多的油脂积累代谢调控相关基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人员发现，来源于产油微生物(圆红冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的异柠檬酸脱氢酶(IDH)和苹果酸酶(ME)的编码基因在土著菌油脂积累过程中有表达差异，酿酒酵母功能互补分析也证明这些基因可增加重组菌株的油脂含量，但并没能将一个非产油菌株成功改造成一个产油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,94(4)，1095-1105]。实验结果暗示，微生物油脂积累代谢调控可能涉及更多的基因及其间的相互调节和相互作用。
[0005]脂滴(Lipid droplets)是细胞内中性脂肪贮存的主要场所，直径从40nm至100 μ m不等，广泛存在于植物、昆虫和动物细胞中。其由极性单磷脂层包裹中性脂组成的疏水核心而构成，并且表面分布有很多蛋白，成熟脂滴中含量最丰富的表面蛋白是周脂素(perilipin)0做为脂滴相关蛋白家族(PAT家族)成员，周脂素具有典型的PAT-1结构域(氨基端1-1OOaa);其中间1/4部分为疏水氨基酸组成的脂滴锚定结构域，而羧基端则和保护甘油三酯不被水解，增加油脂含量功能相关。Perilipin的功能与其磷酸化状态有关，在基础状态下，perilipin未磷酸化，在脂滴表达形成一种物理屏障，阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯，从而保护脂滴内中性脂免受降解；在能量低下、营养匮乏的条件下，它被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，招募激素敏感脂肪酶(HSL)到脂滴表面，水解中性脂，为细胞提供能量；因此该蛋白在调节脂质储存和降解具有重要作用[Bickel PE, TanseyJT, WelteMA.Biochim Biophys Acta.2009,1791(6),419-440][Miura S, Gan Jff, Brzostowski J,Parisi MJ, Schultz CJ, Londos C，Oliver B, Kimmel AR.J Biol Chem.2002，277(35):32253-32257]。该基因在动物与某些子实体真菌中广泛存在，但是在酿酒酵母中未发现周脂素同源蛋白；在动物体内，周脂素做为一种重要的信号调控“开关装置”，可以调控机体脂肪的储存和释放。
[0006]和动物的脂肪细胞一样，产油酵母合成的甘油三酯以脂滴的形式贮存在细胞内部，随着油脂积累量的增加，脂滴不断变大或相互融合，在油脂积累后期，脂滴几乎占据了整个产油酵母的细胞大小[Zhu Zff, Zhang SF, Liu HW, Shen HW, Lin XP, Yang F，Zhou YJ,Jin GJ, Ye ML, Zou HF, ZhaoZK.Nat.Commun.2012,3,1112, Supplementary Figure S6]。2007年，在金龟子绿僵菌中首次鉴定了周脂素，并证明它具有保护脂滴免受降解的作用[Wang C，St Leger RJ.J Biol Chem.2007，282 (29)，21110-21115]。最近，通过脂滴蛋白质组学研究，我们鉴定禾本红酵母(Rhodotorula graminis)油脂积累期间一种新颖的周脂素(perilipin)样蛋白高丰度表达，并发现该蛋白的丰度与油脂含量成正比，将其命名为RgrLDPl (R.graminis lipid droplet proteinl,禾本红酵母脂滴蛋白I),根据实验结果,推测该基因与产油微生物油脂积累、贮运和代谢调控密切相关。截止专利提交日，NCBI上未检索到关于禾本红酵母周脂素的任何序列信息。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用。
[0008]本发明提供的产油酵母脂滴蛋白，名称为RgrLDPl (R.graminis lipid dropletproteinl,禾本红酵母脂滴蛋白I),来源于禾本红酵母R.graminis ATCC MYA-4893,是由如下a)或(b)的蛋白质:
[0009](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010](b)将SEQ ID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相关活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。
[0011]其中所述“脂滴蛋白相关活性”是指促进脂滴融合、生长，增加脂滴内油脂积累，稳定脂滴形态与功能，参与油脂贮运和代谢调控相关的脂滴蛋白活性。
[0012]为了使本发明的产油酵母脂滴蛋白便于纯化，可以在上述(a)或(b)蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013]表1用于纯化的标签及其序列
[0014]
【权利要求】
1.一种产油酵母脂滴蛋白，是下述(a)或(b)的蛋白质: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相关活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。
2.一种编码权利要求1的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQID NO:2所示的DNA分子。
4.包含权利要求2或3的核苷酸序列的重组载体。
5.一种重组细胞，所述细胞导入权利要求4所述的重组载体。
6.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括:将权利要求2或3所述基因导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞而导入权利要求2或3所述的基因。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞选自酵母、微藻、红球菌或大肠杆 菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母或禾本红酵母，所述微藻选自衣藻或聚球藻，所述红球菌是浑浊红球菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述衣藻是莱茵衣藻。
【文档编号】C12R1/645GK103965305SQ201310039369
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月31日 优先权日:2013年1月31日
【发明者】赵宗保, 朱志伟, 张素芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所