专利名称：丝胶肽在冷冻干燥或冷冻保藏益生菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及益生菌的冻藏技术，具体地涉及一种用于益生菌冷冻干燥或冷冻保藏中的保护剂，属于食品工程中微生物技术领域。
背景技术：
益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的细菌，可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡。益生菌具有丰富的生理功能如:增强人体免疫力；抑制有害菌在肠内的繁殖，减少毒素，促进肠道蠕动，改善排便状况，从而提高肠道机能与肠道消化系统健康；帮助维生素BpByB6等营养成分吸收；降低血清胆固醇等。因此，益生菌是一种重要的保健功能因子，经特殊工艺制成微生态制剂，可以广泛应用于食品、医药保健、饲料和农业等各领域中。益生菌冷冻干燥制剂因为活菌保藏期与货架期长、活菌数量高而被广泛研究和应用。冷冻干燥过程一般会造成益生菌的细胞膜 通透性改变、蛋白质变性失活、PH值的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等，从而导致冻干产品中益生菌的大量死亡。因此，在益生菌制剂的生产过程中，为了保护益生菌的活性，除了控制工艺外，最关键的是筛选合适的冷冻保护剂。目前常用于益生菌的冷冻保护剂主要有糖类物质，包括海藻糖、蔗糖、水苏糖等，还包括一些蛋白质类物质。如将水苏糖作为冻干保护剂的成分之一，应用于双歧杆菌和乳酸菌的冷冻干燥(中国发明专利申请:200910091973.X)，由质量比(W/W)为4:4:3:4的蔗糖、麦芽糖、山梨醇和谷氨酸形成的组合冷冻保护剂应用于乳酸菌的冷冻保藏(中国发明专利申请:200310115572.6)。丝胶肽是以桑蚕茧为原料，采用现代生物工程技术，将包覆在桑蚕丝质外层的胶体蛋白定向酶切成小分子多肽，再经过干燥制成。丝胶肽具有非常特殊的氨基酸组成，如富含有带羟基的氨基酸，尤其是丝氨酸含量高达31%。丝胶肽具有丰富的功能作用，主要包括保湿、控油、防晒、抗氧化、激活肌肤细胞、防衰老等功效。目前，还没有将丝胶肽直接作为益生菌冷冻干燥保护剂的研究和报道。因此，本发明研究了丝胶肽作为一种新型的天然冷冻干燥保护剂的效果及其具体应用，进一步开拓了丝胶肽在食品生产技术领域的应用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供丝胶肽的一种新用途，即作为一种益生菌冷冻干燥或冷冻保藏的保护剂以及上述保护剂在冷冻干燥制备益生菌菌剂或者冷冻保藏益生菌菌种中的应用。发明人在研究丝胶肽的综合应用过程中，意外的发现，丝胶肽对微生物的冷冻干燥以及冷冻保藏具有良好的保护作用，能够有效提高冻干菌剂中菌种的成活率，从而可以用于制备冷冻干燥菌剂。而在益生菌菌剂制备过程中，同样面临着如何提高益生菌菌种成活率的问题，应用本发明的方法，能够有效提高冻干益生菌菌剂中益生菌的成活率，且丝胶肽具有一定的营养保健价值，含有丝胶肽的益生菌菌剂非常适合于开发益生菌保健品或益生菌药物。本发明通过以下技术方案实现。丝胶肽在冷冻干燥制备益生菌菌剂或冷冻保藏益生菌菌种中的应用，所述益生菌是指能以活菌状态达到胃肠道，通过调节肠道菌群组成，对人体或动物健康起促进作用的单一微生物或多种微生物的混合物。所述益生菌为双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌、中介链球菌、粪链球菌和酵母菌中的一种或多种，优选为双歧杆菌和乳杆菌中的一种或两种；所述丝胶肽为丝胶蛋白的酶解产物，相对分子量在IOOOODa 300Da范围内。一种用于冷冻干燥制备益生菌菌剂过程中或者冷冻保藏益生菌菌种过程中的保护剂，所述保护剂组分中含有丝胶肽，所述保护剂为单一丝胶肽组分或者为丝胶肽与其它化合物的组合物，所述其它化合物包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、低聚半乳糖与谷胱甘肽等。在冷冻干燥制备益生菌菌剂过程中，添加丝胶肽的量为，丝胶肽与发酵液的质量百分比为
0.5^5% (W/W)，优选所述发酵液的菌含量>108CFU/mL，在冷冻保藏益生菌菌种过程中，丝胶肽添加到菌悬液中的浓度为0.f 10mg/mL。含有丝胶肽的保护剂在冷冻干燥制备益生菌菌剂中的应用，包括如下步骤，(I)益生菌发酵选定一种或者两种以上的益生菌菌种，在食品级培养基中，进行发酵；(2)添加保护剂益生菌发酵完成后，将丝胶肽添加至步骤(I)所得的发酵液中，混合均匀；(3)冷冻干燥；
将步骤(2)获得的混合物经冷冻干燥制得富含益生菌的菌剂。含有丝胶肽的的保护剂在冷冻保藏益生菌菌种中的应用，包括如下步骤，(I)制备菌泥；选定一种或者两种以上的益生菌菌种接种至培养基中发酵,发酵后离心收集菌泥；(2)添加保护剂；将菌泥用灭菌去离子水悬浮，将丝胶肽加入至菌悬液中，混匀得混合液；(3)冷冻保藏；将步骤(2)所得混合液分装于冷冻管中，置于一 20°C条件下冻藏。本发明中所用的丝胶肽，具有如下特征:(I)丝胶肽为丝胶蛋白的酶水解产物，是一种天然生物活性物质；(2)丝胶肽相对分子量在10000Da 300Da范围广泛分布，其中冷冻干燥保护作用较优的丝胶肽分布在3000Da以下；(3)丝胶肽主要氨基酸组成为:18%天冬氨酸，8%苏氨酸，31%丝氨酸，8%谷氨酸，10%甘氨酸，4%丙氨酸。其中带羟基的氨基酸丝氨酸与苏氨酸的含量高达39%。将丝胶肽用于益生菌的冷冻干燥，指的是将含丝胶肽的保护剂应用在益生菌的冷冻干燥(或冷冻保藏)过程中，能大幅抑制菌种死亡，从而提高冻干(或冻藏)益生菌存活率及贮藏的稳定性。所述的丝胶肽在益生菌冷冻干燥过程中的应用，具体地指，选定一种或者两种以上的混合菌种，在食品级培养基中进行发酵，优选10(T200g/L脱脂乳培养基，然后添加一定质量百分比浓度的丝胶肽至发酵乳中，混合均匀后，分装在无菌培养皿中，在-20°C冻藏12h，然后在温度<-50°C，真空度<20pa条件下冷冻干燥16 24h，制得具有良好存活率的益生菌粉末。优选丝胶肽与发酵乳的质量百分比为0.5 5% (W/W)。所述的丝胶肽在益生菌冷冻保藏过程的应用，具体地指，选定一种或者两种以上混合菌种，接入M17肉汤培养液中37°C，180rpm过夜培养至稳定期，所述稳定期是指菌悬液在600nm处吸光值达到1.2 1.4，再以10% (V/V)比例接种于M17肉汤中培养4h，然后4°C下6000rpm离心IOmin,收集菌泥；将菌泥以原培养液相同体积的无菌去离子水悬浮,按体积比1:1取菌悬液与浓度为0.2^20mg/mL的丝胶肽溶液混和均匀，混合液中，丝胶肽的最终含量为0.riOmg/mL然后将混合液分装于冷冻管中，置于_20°C进行冻藏，冻藏的益生菌具有良好的存活率。所述的益生菌存活率主要采用如下检测方法进行分析:将含有益生菌的样品，用无菌去离子水梯度稀释到一定浓度；预先分装在试管中的M17半固体培养基(琼脂浓度为0.3% (g/mL))，每管9mL，121°C灭菌15min后，置于45°C水浴摇床中，避免琼脂冷凝沉降。然后取益生菌样品稀释液ImL加入到盛有9mL无菌M17半固体培养基的试管中，小心混合，避免产生气泡。接菌的试管放在恒温培养箱中37°C静置培养24h 48h后，统计菌落数(CFU)，菌落数控制在30 300之间。检测样品冻干或冻藏前后
的活菌数，存活率按下列公式计算得到:
权利要求
1.丝胶肽在冷冻干燥制备益生菌菌剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌是指能以活菌状态达到胃肠道，通过调节肠道菌群组成，对人体或动物健康起促进作用的单一微生物或多种微生物的混合物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述益生菌为双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌、中介链球菌、粪链球菌和酵母菌中的一种或多种；所述丝胶肽为丝胶蛋白的酶解产物，相对分子量在IOOOODa 300Da范围内。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述益生菌为双歧杆菌和乳杆菌中的一种或两种。
5.含有丝胶肽的保护剂在冷冻干燥制备益生菌菌剂过程中或者冷冻保藏益生菌菌种过程中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，包括如下步骤， (1)益生菌发酵 选定一种或者两种以上的益生菌菌种，在食品级培养基中，进行发酵； (2)添加保护剂 益生菌发酵完成后，将含丝胶肽的保护剂添加至步骤(I)所得的发酵液中，混合均匀； (3)冷冻干燥； 将步骤(2)获得的混合物经冷冻干燥制得富含益生菌的菌剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于， 所述步骤(I)中，所述益生菌为双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌、中介链球菌、粪链球菌和酵母菌中的一种或多种；所述食品级培养基为10(T200g/L的脱脂乳培养基； 所述步骤(2)中，添加含丝胶肽的保护剂的量为，丝胶肽与所述发酵液的质量百分比为0.5 5% ； 所述步骤(3)，冷冻干燥的步骤为，将步骤(2)所得的混合物置于-20°C冻藏12h，然后在温度<-50°C，真空度<20pa条件下冷冻干燥16 24h。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于， 所述步骤(2)中，添加含丝胶肽的保护剂的量为，丝胶肽与所述发酵液的质量百分比为1.2%。
9.如权利要求5所述的应用，包括如下步骤， (1)制备菌泥 ； 选定一种或者多种益生菌菌种接种至培养基中发酵，发酵后离心收集菌泥； (2)添加保护剂； 将菌泥用灭菌去离子水悬浮，将含丝胶肽的保护剂加入至菌悬液中，混匀得混合液； (3)冷冻保藏； 将步骤(2)所得混合液分装于冷冻管中，置于-20°C条件下冻藏。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于， 所述步骤(I)中，所述益生菌为双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌、中介链球菌、 粪链球菌和酵母菌中的一种或多种，所述培养基为M17肉汤培养基； 所述步骤(2)中，所述混合液中丝胶肽的含量为0.f 10mg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种新型益生菌冷冻干燥保护剂丝胶肽及其应用。本发明提供的丝胶肽是由丝胶蛋白通过酶水解制备得到的产物，相对分子量在10000Da~300Da范围广泛分布，活性较优的组分主要分布在3000Da以下，其氨基酸组成特点是带羟基的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸含量高达39%。丝胶肽对冷冻干燥或冷冻保藏两歧双歧杆菌和保加利亚乳酸杆菌等益生菌具有较高的冻干或冻藏保护率且保护效果稳定。本发明优点是将丝胶肽用作益生菌的冷冻干燥或冷冻保藏保护剂，拓宽了丝胶肽作为一种具有营养和保健功能的天然冷冻干燥保护剂的应用。
文档编号C12N1/04GK103103124SQ20131005262
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者吴金鸿, 周炎富, 王正武, 何亚雯, 姚芳懿, 荣玉芝 申请人:上海交通大学