专利名称：一种南极冰藻cpd光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学技术领域,具体涉及南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L中CPD光修复酶、其编码基因，以及南极冰藻CPD光修复酶的应用。
背景技术：
随着现代工业生产的高速发展，大气层中臭氧层遭到了破坏，南北两极臭氧空洞的出现、扩大，使得辐射到地球表面的太阳光中紫外线增强，导致生物圈受紫外线伤害日益严重。大剂量的紫外线(主要是UV-B)对整个地球生态环境来说是一个灾难性的威胁。紫外线已明显地抑制了南极水域中浮游植物群落的光合作用。其危害的根本原因是，生物体中DNA的四种碱基在近紫外波段(UV-B，280 320nm)有强吸收，进而诱发DNA同一条链内相邻的嘧 啶碱基产生嘧啶二聚体，破坏DNA结构，这些损伤将可引起变异，或导致细胞死亡。紫外线也给人类皮肤健康带来严重的威胁，由于人皮肤细胞DNA极易吸收中波紫外线，对DNA造成损伤，因此近年来皮肤癌、黑瘤病的发病率激增。近年来DNA光致损伤与修复机制的研究，尤其对DNA上氧化态胸腺嘧啶二聚体修复机理的研究引起了人们的极大关注，研究极地耐辐射植物的光修复机理，将其应用于工业化生产，对生物和人类的生存极为重要。南极冰藻生长在南极海冰、海冰边缘或海水中，是一种极端微生物。在南极生态系统中占有极其重要的地位，是南极重要的初级生产力，同时也是南极浮游动物、磷虾、鱼类的重要实物来源。强紫外线辐射是南极生物所承受的主要环境胁迫之一。尽管生活在强辐射的环境中，南极冰藻仍旺盛生长繁殖，这预示着南极冰藻细胞内除了合成抗辐射物质来吸收紫外线和清除自由基外，遗传学上对DNA紫外损伤的高效自我修复功能应是其适应这种恶劣环境的关键机制。研究证实，DNA光修复酶承担了修复DNA损伤并保持生物遗传稳定性的重要功能。光修复酶广泛的存在于各种生物中，可以通过色氨酸电子传递链将光信号传递给FAD，FDA发生氧化还原反应改变嘧啶二聚体结构，使之裂解。光修复酶在生物体内的含量极少，每个细胞约有10 20个光修复酶分子，这使得直接进行生物体光修复酶的分离纯化和体外活性等研究极为困难。因此有必要对长期生存于强紫外线辐射条件下的南极冰藻进行深入研究，以利用基因工程手段克隆其光修复酶基因，并将其转化到目的宿主中，使其完成光修复酶的过量表达和纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种南极冰藻(PD光修复酶，是将其编码基因克隆到表达载体中，得到其编码产物，并将编码产物合理应用到化妆品、生物医药等相关领域，从而消除上述背景技术中缺陷。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:一种南极冰藻CPD光修复酶，如(a)或(b)所述的蛋白质:
(a)其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由(a)衍生的蛋白质。(b)所述的蛋白质，例如将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val、或将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸、或将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln等，以上修饰均不改变蛋白活性，且由(a)衍生，均属于本发明的保护范围。本发明还提供了南极冰藻(PD光修复酶的编码基因。南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。或者，与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列，能够编码(b)所述蛋白质的核苷酸序列。例如，针对将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第484-第486个核苷酸，替换为GTT ;或针对将SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3’端缺失33个核苷酸；或针对将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，SEQ ID NO:1所示的核苷酸在5’端第228个核苷酸后添加CAG。本发明还提供了南极冰藻CPD光修复酶的表达载体，该表达载体包括:导入了南极冰藻CPD光修复酶的编码基因而能够编码如(a)或(b)所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。本发明提供的南极冰藻(PD光修复酶的表达载体中，还可以加入选择性标记基因，包括但不限于:可在表 达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因。具体的说，本发明的技术方案是，从南极冰藻转录组中筛查获得目的基因一南极冰藻CPD光修复酶基因片段序列，对此片段在NCBI上进行比对验证。通过RACE得到该基因cDNA全长，同时，根据该基因片段序列设计引物，进行PCR，扩增全长CPD光修复酶基因。同时，通过荧光定量PCR检测该基因在紫外胁迫和强光照射条件下的表达模式。将该基因克隆到原核克隆载体PMD18-T，进行测序验证。将构建好的重组载体经酶切后连接原核表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL21中表达。最终经过亲和层析得到纯化蛋白。为了方便过量表达菌株的鉴定和筛选，可对表达载体进行加工，如加入可产生颜色变化的酶或发光化合物基因(如GFP基因、突光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素标记物。1、南极冰藻总RNA的分离将南极冰藻培养至对数期,用Invitrogen公司的Trizol进行RNA的提取。2、CPD光修复酶基因cDNA序列的获得根据前期获得的冰藻转录组序列设计引物: 5，-RACE 引物 GSPl: CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG3，-RACE 弓丨物 GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT将获得的高质量RNA进行反转录，合成cDNA，进行PCR反应，PCR反应条件为:940C 30s, 72°C 3min, 5 个循环；94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 3min, 5 个循环；94°C 30s, 68°C 30s,72 °C 3min，27 个循环。
3、南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修复酶表达载体构建根据测序得到的光修复酶基因完整序列设计引物:CPDF:TAGAATTCATGCCGAAGCGAACCPDR:TATCTCGAGTCAAGCTCGTGGCPCR 反应条件为:95°C预变性 10min，95°C变性 15s，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min反应进行30个循环；将光修复酶基因的PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a (+)，得到重组质粒；将连接好的重组质粒转化大肠杆菌DH5ci，碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定；鉴定正确的质粒以相同方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，测序鉴定得到重组菌株BL21 (DE3)/pET_28a(+)/phr。4、南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修复酶的纯化和蛋白检测将重组菌BL21 (DE3)/pET-28a(+)/phr接种于含卡那霉素的LB液体培养基培养后，加入IPTG，收集菌体；Ni琼脂糖亲和柱亲和层析，得到目的蛋白。 取上述诱导表达的BL21 (DE3) /pET_28a (+) /phr菌体和纯化的目的蛋白，进行SDS-PAGE恒压电泳，电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。人们在细菌、昆虫、高等植物、脊椎动物和某些低等哺乳动物体内发现了光修复酶及其基因，但在闻等哺乳动物包括人体内尚未发现DNA光修复酶的存在。而在闻等哺乳动物细胞中，核酸外切修复(NER)是修复DNA损伤的最主要途径。有部分群体存在NER修复系统缺乏或不完整，表现出各种疾病，最常见的是着色性干皮病(XP)患者，除此之外Cockayne综合症和光敏型的毛发硫营养障碍症也存在NER修复系统缺乏。因此，光修复酶也可以应用到以上疾病的治疗。本发明将南极冰藻(PD光修复酶应用于保健品、化妆品、生物医药等相关领域以主动修复由紫外线引起病症。例如，防晒霜可以将皮肤与紫外线隔离开来，通过对光的反射和吸收两种机制起作用，以减少紫外线对皮肤的损伤，但无法对损伤的皮肤进行修复。本发明的重组蛋白DNA光修复酶可以作为高级护肤品的功能成分，主动修复由紫外线引起的红斑、皮肤炎症以及基因损伤，延缓衰老，彻底突破了当前“防”紫外线的概念。由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:本发明首次克隆了南极冰藻(PD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量cro光修复酶，并将cro光修复酶应用到保健品、化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。
图1是紫外条件下南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修复酶基因表达变化图；图2是强光条件下南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修复酶基因表达变化图；图3 是 SDS-PAGE 电泳图。
具体实施例方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》。实施例1.南极冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修复酶cDNA序列的获得1、南极冰藻的培养、总RNA的分离将南极冰藻4°C培养至对数期,用Invitrogen公司的Trizol进行RNA的提取。试验按照Trizol试剂的提取流程说明进行操作，在整个过程中保证无RNase污染，将提取的RNA分装成小份，冻存于_80°C冰箱备用。2、CPD光修复酶基因cDNA序列的获得根据前期获得的冰藻转录组序列设计引物:5，-RACE 引物 GSP1: CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG3，-RACE 弓丨物 GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT将获得的高质量RNA进行反转录，合成cDNA。5’ -RACE反转录体系如下:
权利要求
1.一种南极冰藻CPD光修复酶,其特征在于:如(a)或(b)所述的蛋白质: (a)其如SEQID NO:2所示的氨基酸序列； (b)将(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有(PD光修复酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的南极冰藻(PD光修复酶，其特征在于:(b)所述的蛋白质，包括:将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val、或将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸、或将SEQID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，而且具有CPD光修复酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
3.编码如权利要求1或2所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因。
4.如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，其特征在于:其如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，其特征在于:与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。
6.南极冰藻CPD光修复酶的表达载体,其特征在于:所述表达载体包括:导入了如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶编码基因而能够编码如(a)或(b)所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。
7.如权利要求6所述的南极冰藻CPD光修复酶的表达载体,其特征在于，所述表达载体中加入选择性标记基因。
8.如权利要求1或2所述南极冰藻CPD光修复酶在化妆品领域的应用。
9.如权利要求1或2所述南极冰藻CPD光修复酶在生物医药领域的应用。
全文摘要
本发明公开了一种南极冰藻CPD光修复酶，如(a)或(b)所述的蛋白质(a)其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由(a)衍生的蛋白质；本发明同时公开了所述南极冰藻CPD光修复酶的编码基因、表达载体，以及该南极冰藻CPD光修复酶在化妆品、生物医药相关领域的应用。本发明首次克隆了南极冰藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量CPD光修复酶，并将CPD光修复酶应用到化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。
文档编号C12N15/60GK103160488SQ20131012183
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者缪锦来, 许建方, 马莉 申请人:青岛恒生生物制药技术开发有限公司