专利名称：一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法
技术领域：
本发明属于胚胎体外培养领域，尤其涉及一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法。
背景技术：
胚胎体外培养经历了胚胎与单独专用培养液培养、不同培养液序贯共培养、与单层辅助细胞(Helper Cell)共培养、与不同单层辅助细胞序贯共培养等阶段。胚胎体外培养技术的研究为胚胎体外操作提供了可能。体外胚胎培养有力促进了育种学、发育生物学、生殖医学及胚胎工程学等学科的发展。近年来随着胚胎培养液的不断改进，胚胎的体外发育率也得到了很大提高。但由于脱离母体环境，胚胎的发育率及质量仍有很多问题。如体外生产的胚胎染色体倍型异常率较高，rRNA基因的活性明显降低，许多蛋白因子基因的表达存在一定的差异，胚胎冷冻保存的效果较差体。外培养系统缺陷是导致胚胎吸收、死亡、流产、死胎或出生后死亡、以及胎儿过大综合症(Overgrowth Syndromes)的一个重要原因。哺乳动物早期胚胎的发育始于输卵管，然后进入子宫，最终在子宫发育为胎儿。因此更近似地模拟体内发育程序和发育环境是提高体外培养胚胎发育率和发育质量的有效方法。目前，胚胎体外共培养研究仅限于某种单层培养细胞与胚胎一直共培养到囊胚，这种体系虽然提高了胚胎体外发育率及发育质量，但输卵管上皮细胞或子宫内膜上皮细胞在体内处于紧密排列的柱状三维状态，而体外单层培养的这些细胞则呈铺路石状无序排列，因此其在形态和生理功能上与体外仍然有很大差异，不能很好地模拟体内发育环境。
发明内容
针对以上问题，本发明实施例提供了一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法。本发明实施例是这样实现的，一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，该方法包括以下步骤:步骤一、制备I型液态鼠尾胶原；步骤二、分离新西兰大白兔的输卵管上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立输卵管上皮细胞的三维培养体系；步骤三、分离新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立子宫内膜上皮细胞的三维培养体系；步骤四、倾去输卵管上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系培养；步骤五、倾去子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将发育至桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养。
进一步、分离获得的新西兰大白兔的输卵管上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。进一步、分离获得的新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。进一步、小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系中培养时间为24-30小时。进一步、桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养至囊胚阶段。本发明提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法利用细胞三维培养技术，使在体外培养的输卵管上皮细胞和子宫内膜上皮细胞与体内状态接近，将胚胎先在输卵管上皮细胞的三维培养体系共培养，然后再在子宫内膜上皮细胞三维培养体系中共培养，从而在程序和发育环境上建立了一种更近似模拟体内生理环境的胚胎体外培养方法，可显著提高小鼠胚胎的体外发育率，改善发育质量。
图1是本发明实施例提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 图1示出了本发明提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。如图1所示，本发明的实施例提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法包括以下步骤:步骤一、制备I型液态鼠尾胶原；步骤二、分离新西兰大白兔的输卵管上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立输卵管上皮细胞的三维培养体系；步骤三、分离新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立子宫内膜上皮细胞的三维培养体系；步骤四、倾去输卵管上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系培养；步骤五、倾去子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将发育至桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养。作为本发明实施例的一优化方案，分离获得的新西兰大白兔的输卵管上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。作为本发明实施例的一优化方案，分离获得的新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。
作为本发明实施例的一优化方案，小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系中培养时间为24-30小时。作为本发明实施例的一优化方案，桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养至囊胚阶段。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。本发明实施例提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法利用细胞三维培养技术，使在体外培养的输卵管上皮细胞和子宫内膜上皮细胞与体内状态接近，将胚胎先在输卵管上皮细胞的三维培养体系共培养，然后再在子宫内膜上皮细胞三维培养体系中共培养。本发明实施例提供的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法具体方法分以下步骤:1、制备I型液态鼠尾胶原。2、分离新西兰大白兔的输卵管上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上用DMEM培养液原代培养2-3天， 建立输卵管上皮细胞的三维培养体系。3、分离新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上用DMEM培养液原代培养2-3天，建立子宫内膜上皮细胞的三维培养体系。4、倾去输卵管上皮细胞的三维培养体系中DMEM培养液，换成CZB为培养液，将小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系培养24-30小时；之后倾去子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中DMEM培养液，换成CZB为培养液，将发育至桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养至囊胚阶段。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤一、制备I型液态鼠尾胶原； 步骤二、分离新西兰大白兔的输卵管上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立输卵管上皮细胞的三维培养体系； 步骤三、分离新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立子宫内膜上皮细胞的三维培养体系； 步骤四、倾去输卵管上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系培养； 步骤五、倾去子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将发育至桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养。
2.如权利要求1所述 的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，其特征在于，分离获得的新西兰大白兔的输卵管上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。
3.如权利要求1所述的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，其特征在于，分离获得的新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞接种后采用DMEM培养液进行培养，培养时间为2-3天。
4.如权利要求1所述的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，其特征在于，小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系中培养时间为24-30小时。
5.如权利要求1所述的利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，其特征在于，桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养至囊胚阶段。
全文摘要
本发明公开了一种利用三维序贯共培养进行胚胎体外培养的方法，该方法步骤如下制备I型液态鼠尾胶原；分离新西兰大白兔的输卵管上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立输卵管上皮细胞的三维培养体系；分离新西兰大白兔子宫内膜上皮细胞，接种于I型液态鼠尾胶原上，培养建立子宫内膜上皮细胞的三维培养体系；倾去输卵管上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将小鼠受精卵置于输卵管上皮细胞的三维培养体系培养；倾去子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中的培养液，换成CZB为培养液，将发育至桑葚胚阶段的小鼠胚胎转入子宫内膜上皮细胞的三维培养体系中培养。本发明可显著提高小鼠胚胎的体外发育率，改善发育质量。
文档编号C12N5/073GK103232970SQ201310171828
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者宋宇轩, 曹斌云, 安小鹏 申请人:西北农林科技大学