体外胚胎操作试验盒及试验方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胚胎生物学技术领域，更具的说，涉及一种体外胚胎操作试验时使用的试验盒及其试验方法。
【背景技术】
[0002]胚胎是细胞生物学，生殖生物学，发育生物学及胚胎工程领域的主要研宄对象。目前胚胎体外操作实验存在以下问题:
[0003]1、胚胎和贴壁生长的细胞不同，不能直接固定在载玻片或培养皿中，因此每步操作都需要用口吸管将胚胎转移至其他液滴中，操作繁琐，且易丢失胚胎。
[0004]2、试验用试剂多有毒性，对科研工作者，特别是采用口吸管移取胚胎操作，存在一定的伤害风险。
[0005]3、一些试验试剂还具有扩散性特性，每步操作若需等待20-30min时，往往液滴干涸，使胚胎出现浸润不彻底、干燥、变形、崩裂、丢失等现象而无法进行下一步操作，导致试验失败。
[0006]4、用于胚胎试验的载体通常为培养皿或是4/6/12/24孔板，在培养皿中操作，液滴易扩散或是连在一起，难以辨别胚胎的组别；在4/6/12/孔板中，底部面积较大，不仅浪费试剂，而且在显微镜下寻找胚胎需时较长；在24孔板中操作，板孔太深，易使吸胚针折断，胚胎易丢失。
[0007]以上几点问题，不利于试验操作，并可能影响试验成功率和试验效率。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种体外胚胎试验操作用试验盒及使用方法，该试验盒操作简便，用其进行胚胎操作试验可提高试验效率和试验成功率。
[0009]体外胚胎操作试验盒，包括操作皿和操作皿盒。操作皿包括操作皿本体、操作皿盖和密封塞，操作皿盖可以覆盖整个操作皿的上端面。操作皿本体内部为中空腔，操作皿本体侧壁设置有连通口，使中空腔与外界相通，连通口向外有一延伸部，外接抽气装置，延伸部处设置有止回阀；沿操作皿上端面向操作皿本体内，设置有多个互不相通的凹槽，试验中，凹槽用来防止不同组别胚胎和试剂混合在一起。试验时可根据具体试验分组，选择相应数量的凹槽使用。密封塞与凹槽配合，每个凹槽的顶部均有与其相匹配的密封塞，塞住凹槽口。所述凹槽的槽底为超滤膜，超滤膜具有一定的弧度，超滤膜孔径<最小胚胎直径，保证胚胎放置其中不能透过此膜。根据具体的试验需求，可定制超滤膜，例如，当进行胚胎蛋白试验时，需同时保证最大蛋白直径<超滤膜孔径。由于不同的试验对试剂量的需求不同，凹槽的容积可根据试验对试剂量的需求进行特殊设计。沿凹槽侧壁设置有引流柱，引流柱用于规范试验试剂的流动。所述操作皿盒为不透光盒，可包裹住整个操作皿。
[0010]优选的是:密封塞包括塞架和塞头，所述塞架包括多条塞骨，多条塞骨汇聚到一点，形成伞骨形塞架，塞头设置在塞骨的末端，塞骨的个数与操作皿本体内凹槽的个数相同，保证每个凹槽均有与其配合的塞头。
[0011]优选的是:操作皿内部，在操作皿底和凹槽之间沿操作皿侧壁设置有一斜面，所述斜面覆盖整个操作皿底的范围，保证每个凹槽内流出的试剂均可落到斜面上，斜面较高的一端位于与连通口相对一侧的操作皿本体的侧壁上，较低的一端，位于连通口处；斜面结构有利于试验试剂流动到连通口处。
[0012]更进一步的:引流柱底部与斜面相接，用过的试剂可沿引流柱流到斜面上。
[0013]优选的是:操作皿盒为不透光盒，操作皿盒底部覆盖吸水材料，使用前加入少量水，使吸水材料浸湿。操作皿盒用于为操作皿提供一个黑暗潮湿的环境，以使其适用于特定的试验需求。
[0014]采用体外胚胎操作试验盒进行胚胎试验的方法，包括以下步骤:
[0015]S1:在操作皿连通口处连接一抽气装置，准备待测胚胎，对胚胎分组，根据胚胎分组数，打开相应数量的密封塞；
[0016]S2:将试验用试剂滴入凹槽内，将待测试胚胎移入凹槽内，处理相应的时间后，启动抽气装置，止回阀打开，此时，操作皿本体内中空腔的压力小于外界压力，试验用过的试剂透过超滤膜，流入中空腔底部关闭抽气装置，止回阀关闭，中空腔内外压力恢复平衡；
[0017]S3:将下一种试验用试剂滴入凹槽内，反应完成后，启动抽气装置，试验用过的试剂透过超滤膜，流入中空腔底部；
[0018]S4:重复S3中的操作，直至试验结束。
[0019]本发明的有益效果是:
[0020]1、本发明提供的试验盒中的操作皿，是专为胚胎试验设计的，保证在一个完整的试验周期过程中，胚胎都保持在操作皿的凹槽内部，每步操作过程中，在不移动胚胎的前提下，方便更换试剂，减少每步操作都需要移动胚胎来更换液滴的操作，减少因反复移动胚胎而导致的胚胎丢失现象，提高试验效率，简化操作步骤，同时可避免用口吸管移取胚胎时试剂对操作者造成伤害的危险。
[0021]2、本发明试验盒可高压灭菌，多次重复利用，即节约试验成本又环保。
[0022]3、本发明试验盒中的操作皿各凹槽之间互不相通，可同时操作多组胚胎，也可同时进行不同的检测试验。
[0023]4、在操作皿本体的中空腔内设置斜面，在每个凹槽侧壁设置引流柱，使试验后的试剂可沿引流柱流到斜面上，再经由斜面流到连通口处，便于收集试验过的试剂。
【附图说明】
[0024]图1为本发明结构示意图。
[0025]图2为本发明主视结构示意图。
[0026]图3为【具体实施方式】I试验结果图，采用本发明进行小鼠胚胎HSP70蛋白免疫荧光检测试验所得到的HSP70蛋白表达情况图。
[0027]图4为【具体实施方式】2试验结果图，采用本发明进行小鼠囊胚Bcl-2蛋白和Bax蛋白免疫荧光检测试验所得到的Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达情况图。
[0028]图5为【具体实施方式】3试验结果图，采用本发明进行小鼠囊胚地衣红染色，统计囊胚细胞总数试验所得到的囊胚细胞染色结果图。
[0029]其中，1-操作皿本体；2-凹槽；3-连通口 ；4-延伸部；5-止回阀；6-引流柱；7-斜面；8-塞骨；9-塞头；10-超滤膜。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图对本发明做进一步详细的说明。
[0031]实施例1:
[0032]本实施例以小鼠胚胎HSP70蛋白免疫荧光检测试验为例，来说明本发明提供的胚胎试验盒的结构和试验方法。
[0033]试验前，配制试剂。本试验所应用的试剂包括固定液、孵育液、清洗液、封闭液A、封闭液B、PI染液和抗荧光淬灭剂。上述固定液为含4%的多聚甲醛的PBS液；上述孵育液为含 0.285g/LMgCl2、2.947g/LNaCl、4.77g/LHepesU02.69g/L 蔗糖，lg/LNaN3和 0.5%TritonX-100 的水溶液；上述清洗液为含 0.1 % Tffeen-20 和 0.01 % TritonX-1OO 的 PBS 液；上述封闭液A为含1% BSA的清洗液；上述封闭液B为含I % BSA和112.5g/L甘氨酸的清洗液；上述PI染液为PI含量为10 μ g/mL的PBS液；上述抗荧光淬灭剂为含8.9g/LDABC0、4.4% Tris-HCl (0.2M，pH7.4)，40%甘油的水溶液。配置好上述试剂，将其存放于棕色瓶中，加盖密封，置于4°C冰箱保存，保存期限一年。
[0034]体外胚胎操作试验盒，包括操作皿，操作皿包括操作皿本体1、操作皿盖和密封塞，操作皿盖可以覆盖整个操作皿的上端面。操作皿本体I内部为中空腔，操作皿本体I侧壁设置有连通口 3，使中空腔与外界相通，连通口 3向外有一延伸部4，延伸部4处设置有止回阀5，延伸部4末端为橡胶管，外接抽气装置；沿操作皿上端面向操作皿本体内，设置有多个互不相通的凹槽2，凹槽2的容积100 μ L，密封塞与凹槽2配合，每个凹槽2的顶部均有与其相匹配的密封塞，塞住凹槽口。凹槽2的槽底为超滤膜10，超滤膜10具有一定的弧度，HSP70蛋白直径<超滤膜10孔径<小鼠胚胎直径，保证胚胎放置其中不能透过此膜。沿凹槽2侧壁设置有引流柱6，引流柱6用于规范试验试剂的流动。
[0035]密封塞包括塞架和塞头9，塞架包括多条塞骨8，多条塞骨8汇聚到一点，形成伞骨形塞架，塞头9设置在塞骨8的末端。塞骨8采用柔性材料，移动方便。塞骨8的个数与操作皿本体内凹槽2的个数相同，保证每个凹槽2均有与其配合的塞头9。
[0036]操作皿内部，在操作皿底和凹槽2之间沿操作皿侧壁设置有一斜面7，斜面7覆盖整个操作皿底的范围，保证每个凹槽2内流出的试剂均可落到斜面7上，斜面7较高的一端位于与连通口 3相对一侧的操作皿本体的侧壁上，较低的一端，位于连通口 3处；斜面7结构有利于试验试剂流动到连通口 3处。每个引流柱6底部均与斜面7相接，试验试剂可沿引流柱6流到斜面7上。
[0037]体外胚胎操作试验盒还包括与其配套使用的操作皿盒，操作皿盒为不透光盒，可包裹住整个操作皿本体，操作皿盒底部覆盖吸水材料，使用前加入少量水，使吸水材料浸湿。操作皿盒用于为操作皿提供一个黑暗潮湿的环境，以使其适用于特定的试验需求。
[0038]试验具体过程如下:
[0039]1、采用注射器作为抽气装置，试验前，将注射器与延伸部4处的橡胶管相连接。
[0040]2、本试验涉及四组胚胎，试验前对四组胚胎记录编号，打开四个凹槽2上的密封塞塞头9。
[0041]3、将固定液50 μ L滴入凹槽2中，将各阶段的四组小鼠胚胎分别移入不同的凹槽2中，并做好标记，盖上操作皿盖，固定，桑椹胚之前固定30min，桑椹胚后固定40min。固定结束后，轻轻抽注射器，使固定液透过超滤膜10，沿引流柱6被引出，流入中空腔内，流到斜面7上。
[0042]4、将孵育液50 μ L滴入凹槽2，盖上操作皿盖，对胚胎进行透膜处理，桑椹胚之前孵育30min，桑椹胚之后孵育40min。孵育结束后，轻轻抽注射器，使孵育液透过超滤膜10，沿引流柱6被引出，流入中空腔内，流到斜面7上。
[0043]5、将封闭液A50 UL滴入凹槽2，盖上操作皿盖，将胚胎在室温下封闭处理lh。封闭结束后，轻轻抽注射器，使封闭液A透过超滤膜10，沿引流柱6流入中空腔内，流到斜面7上。
[0044]6、根据抗体使用说明书，用封闭液B，按1:50的比例稀释HSP70抗体，将50 μ L稀释后的HSP70抗体滴入凹槽2中，盖上密封塞，断开注射器与橡胶管的连接，并盖上操作皿盖，在操作皿盒中注入少量水，使操作皿盒中吸水材料浸湿，将操作皿放入操作盒中，4°C冰箱中过夜孵育。
[0045]7、从冰箱中取出操作盒，在室温下静置复温30min，重新连接注射器与橡胶管，打开密封塞，轻轻抽注射器，使一抗孵育液透过超滤膜10，沿引流柱6流入中空腔内，流到斜面7上。使用清洗液清洗三次，每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。每次清洗后都抽动注射器，使清洗液透过超滤膜10，沿引流柱6引出，流入中空腔内。
[0046]8、清洗后，根据FITC标记Ant1-GoatIgG说明书，将