FITC标记Ant1-GoatIgG用清洗液稀释(1:400)，然后滴入50 μ L，盖上操作皿盖，对胚胎进行室温二抗孵育lh。二抗孵育结束后，轻轻抽注射器，使二抗孵育液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0047]9、使用清洗液清洗三次每滴50 μ L，5min/次。每次清洗后都抽动注射器，以将清洗液从凹槽2中引出。
[0048]10、滴加PI染液50 μ L，盖上操作皿盖，室温下，桑椹胚之前染色lOmin，桑椹胚后染色15min。染色结束后，轻轻抽注射器，使PI染液透过超滤膜10，沿引流柱6引出，流入中空腔。
[0049]11、使用清洗液清洗三次，每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。前两次清洗后，轻轻抽注射器，使清洗液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。最后一次清洗液不用引出。
[0050]12、在载玻片中央滴加0.8-1 yL左右的抗荧光淬灭剂，再在其周围点上四个蜡柱(蜡柱成分为凡士林)。然后用口吸管将上述处理后的胚胎放在此抗荧光淬灭剂滴中，用盖玻片轻压蜡柱，通过体式显微镜观察到早期胚胎固定不动即可，防止压力过大使其变形或碎裂。最后在载玻片上标记出抗体名称，胚胎所处的时期及数量，封片日期。
[0051]13、使用激光共聚焦显微镜进行观察，并扫描成图像。
[0052]14、试验结束后，在凹槽2内加入超纯水反复冲洗凹槽2，并用注射器吸出凹槽2中的液体，高压灭菌，烘干，以便下次再用。
[0053]图3为采用本实施方式进行小鼠胚胎免疫荧光试验得到的试验结果。由附图可见，采用本发明进行小鼠胚胎HSP70蛋白免疫荧光检测，可准确标记小鼠胚胎HSP70蛋白。
[0054]实施例2:
[0055]与实施例1不同的是，本实施例将进行小鼠囊胚Bcl-2蛋白和Bax蛋白免疫荧光检测，由于Bcl-2蛋白的直径大于Bax蛋白的直径，为保证蛋白均布透过超滤膜，采用超滤膜10的孔径，Bcl-2蛋白直径<超滤膜10孔径<小鼠囊胚直径，凹槽容积为80 μ Lo
[0056]1、采用注射器作为抽气装置，试验前，将注射器与延伸部4处的橡胶管相连接。
[0057]2、本试验涉及两组胚胎，试验前对两组胚胎记录编号，打开两个凹槽2上的密封塞塞头9。
[0058]3、将50 μ L固定液滴入凹槽2中，将各组胚胎分别移入不同凹槽2中，并做好记录，盖上操作皿盖，固定40min。固定结束后，轻轻抽注射器，使固定液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0059]4、将50 μ L孵育液滴入凹槽，盖上操作皿盖，对胚胎进行孵育透膜处理40min。孵育结束后，轻轻抽注射器，使孵育液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0060]5、滴加用50 μ L封闭液A，盖上操作皿盖，在室温下封闭处理胚胎lh。封闭结束后，轻轻抽注射器，使封闭液A透过超滤膜，沿引流柱6引出。
[0061]6、根据抗体说明书，用封闭液B稀释Bcl-2(1:50)和Bax(l:50)抗体后滴入凹槽2中，盖上密封塞，断开注射器与橡胶管连接，并盖上操作皿盖，在操作皿盒中注入少量水，使操作皿盒中吸水材料浸湿，将操作皿放入操作盒中，4 °C冰箱中孵育过夜。
[0062]7、从冰箱中取出操作盒，在室温下静置复温30min，重新连接注射器与橡胶管，打开密封塞，轻轻抽注射器，使一抗孵育液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。使用清洗液清洗三次，每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。每次清洗后都抽动注射器，使清洗液透过超滤膜10，将清洗液沿引流柱6引出。
[0063]8、清洗后，根据 FITC 标记 Ant1-RabbitIgG 说明书，将 FITC 标记 Ant1-RabbitIgG用清洗液稀释(1:340)，然后滴入50 μ L，盖上操作皿盖，在室温下二抗孵育胚胎lh。二抗孵育结束后，抽动注射器，使二抗孵育液透过超滤膜10，将二抗孵育液沿引流柱6引出。
[0064]9、使用清洗液清洗三次每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。每次清洗后都抽动注射器，将清洗液沿引流柱6引出。
[0065]10、滴加PI染液50 μ L，盖上操作皿盖，室温下，染色15min。染色结束后，轻轻抽注射器，使PI染液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0066]11、使用清洗液清洗三次每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。前两次清洗后，轻轻抽注射器，使清洗液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。最后一次清洗液不用引出。
[0067]12、在载玻片中央滴加0.8-1 yL左右的抗荧光淬灭剂，再在其周围点上四个蜡柱(蜡柱成分为凡士林)。然后用口吸管将上述处理后的胚胎放在此抗荧光淬灭剂滴中，用盖玻片轻压蜡柱，通过体式显微镜观察到早期胚胎固定不动即可，防止压力过大使其变形或碎裂。最后在载玻片上标记出抗体名称，胚胎所处的时期及数量，封片日期。
[0068]13、使用激光共聚焦显微镜进行观察，并扫描成图像。
[0069]14、试验结束后，在凹槽2内加入超纯水反复冲洗凹槽2，并用注射器吸出凹槽2中的液体，高压灭菌，烘干，以便下次再用。
[0070]图4为采用本实施方式进行小鼠囊胚免疫荧光试验得到的试验结果。由附图可见，采用本发明进行小鼠囊胚Bcl-2蛋白和Bax蛋白免疫荧光检测，可准确标记小鼠囊胚Bcl-2蛋白和Bax蛋白。
[0071]实施例3:
[0072]与实施例1和实施例2不同的是本试验不需要用到操作皿盒，凹槽2的容积为60yL，采用超滤膜10的孔径<小鼠囊胚直径，本实施例以小鼠囊胚地衣红染色统计囊胚细胞总数试验为例，来说明本发明提供的胚胎试验盒的使用方法。
[0073]试验前，配置试验试剂。本试验所应用的试剂包括柠檬酸钠溶液，固定液，醋酸地衣红染色液、PBS。上述柠檬酸钠溶液为0.5%和1%柠檬酸钠的水溶液；固定液为甲醇与冰乙酸按3:1 (V/V)的溶液；醋酸地衣红染色液为45%乙酸中含1%地衣红的染液。配置好上述试剂，将其存放于棕色瓶中，加盖密封，置于4°C冰箱保存，保存期限两年。
[0074]试验具体过程如下:
[0075]1、采用注射器作为抽气装置，试验前，将注射器与延伸部4处的橡胶管相连接。
[0076]2、本试验涉及两组胚胎，试验前对两组胚胎记录编号，打开两个凹槽2上的密封塞塞头9。
[0077]3、将I %柠檬酸钠溶液50 μ L滴入凹槽2中，将各组胚胎分别移入不同凹槽2中，并做好记录，盖上操作皿盖，分散胚胎中细胞20min，然后轻轻抽注射器，使I %柠檬酸钠溶液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0078]4、滴加0.5 %梓檬酸钠溶液50 μ L，盖上操作皿盖，室温下，分散胚胎中细胞30min，然后轻轻抽注射器，使0.5%柠檬酸钠溶液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0079]5、滴加固定液50 μ L，盖上操作皿盖，室温下，固定30min。固定结束后，轻轻抽注射器，使固定液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0080]6、滴加I %地衣红的染色液50 μ L，室温下染色30min，染色结束后，轻轻抽注射器，使染色液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。
[0081]7、室温下清洗胚胎2次，每次滴加PBS50 μ L，3min/次。前一次清洗后，轻轻抽注射器，使清洗液透过超滤膜10，沿引流柱6引出。后一次清洗液不用引出。
[0082]8、用口吸管将胚胎移至APES硅化的载玻片上，干燥，封片，做好标记。
[0083]9、普通光学显微镜下记录每枚胚胎的囊胚细胞总数。
[0084]10、试验结束后，在凹槽2内加入超纯水反复冲洗凹槽2，并用注射器吸出凹槽2中的液体，高压灭菌，烘干，以便下次再用。
[0085]图5为采用本实施方式进行小鼠囊胚地衣红染色统计囊胚细胞总数试验结果。
【主权项】
1.体外胚胎操作试验盒，包括操作皿和操作皿盒，所述操作皿包括操作皿本体、操作皿盖和密封塞，其特征在于:所述操作皿本体内部为中空腔，操作皿侧壁设置有连通口，使中空腔与外界相通，连通口向外有一延伸部，外接抽气装置，延伸部处设置有止回阀；沿操作皿上端面向操作皿本体内，设置有多个互不相通的凹槽，沿凹槽侧壁设置有引流柱，密封塞与凹槽配合；所述凹槽的槽底为超滤膜。
2.如权利要求1所述的体外胚胎操作试验盒，其特征在于:所述密封塞包括塞架和塞头，所述塞架包括多条塞骨，多条塞骨汇聚为伞骨形塞架，塞骨的个数与操作皿本体内凹槽的个数相同，塞头设置在塞骨的末端。
3.如权利要求1所述的体外胚胎操作试验盒，其特征在于:操作皿内部，在操作皿底和凹槽之间沿操作皿侧壁设置有一斜面，所述斜面覆盖整个操作皿底的范围，斜面较高的一端位于与连通口相对一侧的操作皿本体的侧壁上，较低的一端，位于连通口处。
4.如权利要求3所述的体外胚胎操作试验盒，其特征在于:所述引流柱底部与斜面相接。
5.如权利要求1所述的体外胚胎操作试验盒，其特征在于:所述操作皿盒为不透光盒，可包裹住整个操作皿本体，操作皿盒底部覆盖吸水材料。
6.采用权利要求1所述的体外胚胎操作试验盒进行胚胎试验的方法，其特征在于:包括以下步骤: 51:在操作皿连通口处连接一抽气装置，准备待测胚胎，对胚胎分组，根据胚胎组数，打开相应数量的密封塞； 52:将待测试胚胎移入凹槽内，将试验用试剂滴入凹槽内，处理相应的时间后，启动抽气装置，止回阀打开，此时，操作皿本体内中空腔的压力小于外界压力，试验用试剂透过超滤膜，流入中空腔底部，关闭抽气装置，止回阀关闭，中空腔内外压力恢复平衡； 53:将下一种试验用试剂滴入凹槽内，反应完成后，启动抽气装置，试验用试剂透过超滤膜，流入中空腔底部； 54:重复S3中的操作，直至试验结束。
【专利摘要】本发明涉及一种体外胚胎操作试验时使用的试验盒及其试验方法。体外胚胎操作试验盒，包括操作皿，操作皿包括操作皿本体、操作皿盖和密封塞，操作皿本体内部为中空腔，操作皿本体侧壁设置有连通口，使中空腔与外界相通，连通口向外有一延伸部，外接抽气装置，延伸部处设置有止回阀；试验时，在操作皿连通口处连接一抽气装置，将试验用试剂滴入凹槽内，反应完成后，启动抽气装置，试验用过的试剂透过超滤膜，流入中空腔底部。该试验装置及方法可保证在一个完整的试验周期过程中，胚胎都保持在操作皿的凹槽内部，在不移动胚胎的前提下，方便更换试剂，减少每步操作都需要移动胚胎来更换液滴的操作，减少因反复移动胚胎而导致的胚胎丢失现象。
【IPC分类】B01L3-00
【公开号】CN104815711
【申请号】CN201510226094
【发明人】田文儒, 赵园, 迟世凯, 齐晓楠, 李华涛, 丛霞, 曹荣峰, 姜忠玲, 高善颂
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月6日