一种褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的pcr鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学技术对物种鉴定的定性检测方法，具体地说是利用分子生物学技术对褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法。利用F、R1、R2三条特异性标记的引物对褐牙鲆和其近缘外来种大西洋牙鲆的线粒体DNA基因进行扩增，通过扩增出的特异性片段进而区分褐牙鲆与大西洋牙鲆；本发明为在形态学上无法鉴别的褐牙鲆和大西洋牙鲆早期发育时期苗种定性鉴定提供了快速、经济、可靠的分子生物学检测技术，为褐牙鲆苗种增殖放流鉴定及防止外来物种入侵提供了智力支持，同时将加快牙鲆苗种产业的质量检测进程。
CGMCC No.1985
2007.03.22
【专利说明】一种褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术对物种鉴定的定性检测方法，具体地说是利用分子生 物学技术对褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 大西洋牙鲆（Paralichthys dentatus)隶属于鲽形目、鲆科、牙鲆属，主要分布于 北美洲大西洋沿岸，是一种冷水性经济鱼类。褐牙鲆（P. olivaceus)与大西洋牙鲆为同属 近缘物种，生物形态学上极其相似，主要分布西北太平洋沿岸，为亚洲重要的鲆鲽类养殖品 种。为改变我国牙鲆属养殖品种单一局面，大西洋牙鲆于2002年首次从美国引入我国进行 人工培育和养殖。在养殖过程中，大西洋牙鲆呈现生长快速、抗病力强、耐高温能力较牙鲆 高和成活率高等特点，近年来该鱼种已经在我国进行了工厂化、池塘高密度集约化养殖生 产。由于大西洋牙鲆与褐牙鲆的形态特征十分相似，尤其在苗种早期发育时期更是难以从 外部形态上进行快速的鉴别和区分，给牙鲆苗种产业的质量检测带来了困难，对没有任何 分类经验的褐牙鲆苗种养殖户将造成巨大损失，会严重影响褐牙鲆苗种生产的管理及其养 殖产业的发展。另外，随着近年来褐牙鲆野生资源修复计划的启动和实施，褐牙鲆苗种增殖 放流工作以日趋常态化，大西洋牙鲆苗种生产量的剧增为如何确保放流牙鲆苗种为褐牙鲆 纯种以及如何防止外来物种入侵而引起海洋生态失衡等提出了难题。
[0003] 线粒体DNA自20世纪60年代被证实以来，由于其具有结构简单、母性遗传、几乎 不发生重组和进化速率快等特点，呈现出较强的种属特异性，被广泛应用于种间系统发育 进化、种属分类鉴定等分子分类学领域。目前关于生物种质资源检测与鉴定的专利不多，尚 未见到有关褐牙鲆和大西洋牙鲆物种鉴别技术的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明针对大西洋牙鲆与褐牙鲆早期发育形态特征极其相似难以从外部形态上 进行快速鉴别和区分的难题，提供了一种新的简便、快捷、准确地褐牙鲆与其近缘外来物种 种质间的PCR鉴定方法，即褐牙鲆与大西洋牙鲆幼鱼种质鉴定PCR检测方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法，其特征在于：利用F、Ri、R2三条 特异性标记的引物对褐牙鲆和其近缘外来种大西洋牙鲆的线粒体DNA基因进行扩增，通过 扩增出的特异性片段进而区分褐牙鲆与大西洋牙鲆；
[0007] 上游正向引物序列为：F: 5' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3' ；
[0008] 下游反向引物 1 序列为：R1:5' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3' ；
[0009] 下游反向引物 2 序列为：R2:5' GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'。
[0010] 利用F、％、R2三条特异性标记的引物对褐牙鲆和其近缘外来种的线粒体DNA基因 进行扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳条带差异进行种质判定。
[0011] 所述PCR扩增条件为：94°C预变性4min ;40个循环：94°C变性lmin，47°C退火50s， 72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
[0012] 通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示外来种大西洋牙鲆的DNA显 示为2条亮带，褐牙鲆的DNA则显示为1条亮带，进而区分褐牙鲆和大西洋牙鲆物种种质。 即外来种大西洋牙鲆的DNA显示为422bp和201bp的2条相应亮带，褐牙鲆的DNA则显示 为422bp的1条阳性亮带。
[0013] 本发明根据褐牙鲆和大西洋牙鲆线粒体基因组DNA上特异性碱基序列设计三条 特异性标记的引物，因此只对褐牙鲆和大西洋牙鲆有扩增信号，而对其它对照材料没有相 应目的带的扩增信号。
[0014] 线粒体DNA控制区进化速率约为蛋白编码基因的2-5倍，具有较高的突变速率，通 常具有较高的种间多态呈现种属特异性，成为研究近缘物种间遗传分化和系统发育关系非 常理想的分子标记，尤其是对于研究形态相似物种间的遗传分化和发现隐存种是一个非常 重要的研究工具，对于补充和完善形态分类学研究具有重要的意义。
[0015] 上述PCR鉴定方法中的引物，可作为大西洋牙鲆和褐牙鲆的PCR鉴定鉴定试剂盒。
[0016] 本发明是对褐牙鲆和大西洋牙鲆早期发育时期苗种进行分子标记进而得到鉴定， 即在线粒体DNA控制区部分测序的基础上，本发明筛选并设计了针对牙鲆和大西洋牙鲆线 粒体控制区PCR差异扩增三条特异性引物（F、R1和R2)。通过一次普通PCR扩增，琼脂糖凝 胶电泳检测显示种间特征带的有无，即可准确鉴定褐牙鲆及其近缘外来种大西洋牙鲆物种 种质。同时不仅可以对褐牙鲆和大西洋牙鲆苗种及成体进行鉴别，在褐牙鲆苗种增殖放流 纯种鉴定、水产品加工鉴定及食品检测等方面都可以应用。
[0017] 本发明所具有的优点：
[0018] 与其他分子生物学方法相比，本技术发明具有快速稳定、可靠、经济实用等特点， 即采用分子生物学手段，根据线粒体DNA种属特异性，设计出特异分子标记，采用普通PCR 检测方法，在扩增产物凝胶电泳检测结果中，外来种大西洋牙鲆的DNA显示为2条亮带，褐 牙鲆的DNA显示则为1条亮带，从而定性的检测褐牙鲆及其近缘外来物种大西洋牙鲆，因 此，本发明技术简便易行，特异性高，采用本技术发明，可以很容易地将褐牙鲆和其近缘外 来物种大西洋牙鲆区分开来，同时不仅可以加快牙鲆鱼苗种产业种质质量检测进程，而且 可以在褐牙鲆苗种增殖放流纯种鉴定、水产品加工鉴定及食品检测等方面得到快速应用。
[0019] 本发明采用普通PCR检测方法，不仅可以鉴别褐牙鲆和大西洋牙鲆苗种及成体， 还可以鉴别其加工产品，具有快速、可靠、经济实用等特点，填补了国内将分子生物学技术 用于褐牙鲆和大西洋牙鲆物种鉴定的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例提供的褐牙鲆和大西洋牙鲆DNA进行PCR扩增产物凝胶电泳 检测结果的实际图像；
[0021] 图2为本发明实施例提供的图1的反转图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 1.线粒体基因组DNA提取：
[0024] 分别以褐牙鲆及其近缘种大西洋牙鲆幼鱼背部肌肉材料为原料，各取lOOmg并分 别用无菌水处理后，在液氮中研磨成粉末，装入1. 5ml的离心管中，参照分子克隆实验指南 精编版（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔）采用标准酚/氯仿抽提法分别提取原料线粒体基因 组DNA，待用。
[0025] 2.特异引物设计：
[0026] 基于GENBANK数据库公布的褐牙鲆和大西洋牙鲆线粒体全序列及部分控制区序 列，采用DNASTAR8. 0软件进行同源序列比较，利用PRMER5. 0软件辅助设计特异性引物。
[0027] 2.1扩增引物：
[0028] (1)褐牙鲆扩增引物名称及序列：
[0029] 上游引物 F : 5 ' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3 '
[0030] 下游引物札：5 ' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3 '
[0031] 褐牙鲆扩增片段长度：约422bp
[0032] (2)大西洋牙鲆扩增引物名称及序列：
[0033] 上游引物 F : 5，CCCACCACTAACTCCCAAAGC3 '
[0034] 下游引物札：5 ' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3 '
[0035] 下游引物R2:5'GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'（大西洋牙鲆种属特异引物）
[0036] 大西洋牙鲆扩增片段长度：F/%约422bp ;F/R2约201bp
[0037] 3. PCR反应体系及反应条件：
[0038] 3. 1反应体系如下：
[0039] 总反应体系为 20mL，其中 10XPCR 反应缓冲液（lOXbuffer :Tris-HCl (ρΗ8· 3) 10 0mM;KC1500mM;MgCl215mM)2· 5mL，2. 5mM 脱氧核苷三磷酸 2mL, F(10uM) 1. OmL, R1 (10uM) 1. Om L,R2(10uM)0.2mL，Taq DNA 聚合酶（5U/ul)0.2mL，DNA2mL,无菌超纯水补足体系至 20mL。
[0040] 3· 2反应条件如下：
[0041] 94°C预变性 4min ;40 个循环：94°C变性 lmin，47°C退火 50s，72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
[0042] 反应结束后扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果。
[0043] 4.扩增产物检测：
[0044] PCR扩增产物采用浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，加入终浓度为lug/ml的溴 化乙锭（EB)。电泳缓冲液为1XTAE，以AS2000DNA Mark作为DNA分子量标准。电压为120 伏特，电泳30分钟。采用UVP⑶S-8000凝胶成像系统拍照检测。
[0045] 5、结果：
[0046] 以褐牙鲆和大西洋牙鲆幼鱼背部肌肉DNA为模版，分别用三条特异性引物对线粒 体基因进行PCR扩增，结果褐牙鲆和大西洋牙鲆在422bp左右位置都有扩增条带出现（F/% 组合扩增)，在201bp左右位置只有大西洋牙鲆物种有条带（F/R 2组合扩增)，褐牙鲆无条带 (参见图2)。
[0047] 实施例2
[0048] 以褐牙鲆和其近缘外来种大西洋牙鲆幼鱼背部肌肉的DNA为模版，基于实施例1 中的PCR反应条件，以常见养殖鲆鲽类鱼种大菱鲆为阴性对照，通过PCR反应结果显示大西 洋牙鲆样品在422bp和201bp处具有特异性扩增的阳性条带，褐牙鲆样品在422bp处存在 一条阳性扩增条带，而大菱鲆样品则没有出现相应的特异性条带(参见图1)。
[0049] 由上述可知线粒体DNA控制区引物的F/%组合对大西洋牙鲆和褐牙鲆都具有扩 增作用，引物f/r2组合只对大西洋牙鲆具有种属特异性扩增作用，因此，在褐牙鲆和大西洋 牙鲆种间呈现PCR扩增条带的差异，而F/Ri和F/R2组合对大菱鲆等其他鲆鲽类而言是非特 异性的，基于本技术发明手段可以有效的对外来物种大西洋牙鲆进行准确的物种鉴定。
【权利要求】
1. 一种褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法，其特征在于：利用 条特异性标记的引物对褐牙鲆和其近缘外来种大西洋牙鲆的线粒体DNA基因进行扩增，通 过扩增出的特异性片段进而区分褐牙鲆与大西洋牙鲆； 上游正向引物序列为：F:5' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3' ； 下游反向引物 1 序列为TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3' ； 下游反向引物 2 序列为：R2:5' GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'。
2. 按权利要求1所述的褐牙鲆与其近缘外来物种种质间的PCR鉴定方法，其特征在于： 利用F、Rp R2三条特异性标记的引物对褐牙鲆和其近缘外来种大西洋牙鲆的线粒体DNA基 因进行扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳条带差异进行种质判定。
3. 按权利要求1或2所述的鉴定的方法，其特征在于：PCR扩增条件为：94°C预变性 4min ;40 个循环：94°C变性 lmin，47°C退火 50s，72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
【文档编号】C12Q1/68GK104232747SQ201310246976
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2013年6月20日
【发明者】肖永双, 李军, 肖志忠, 马道远, 徐世宏, 刘清华 申请人:中国科学院海洋研究所