检测外来入侵藻类生物的基因芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及藻类生物的分子学检测，具体涉及检测外来入侵藻类生物的基因芯 片。
【背景技术】
[0002] 为使船舶处于稳定适航状态，在船舶底舱注入的适量水体，压舱水含有大量有害 藻类，因在新环境中缺少天敌，这些入侵物种会迅速蔓延，威胁停靠国海洋生态系统的平 衡，给海洋环境、海洋渔业和海水养殖业造成严重危害。据国际海事组织统计，全世界船只 每年约携带100亿吨压舱水在世界各地往来，每天压舱水中至少有700种至1万多种海洋微 生物和动植物在全球流动，凡是具有海岸线或大陆水域的国家都需要监控和检测有害藻 类。藻类传统检测主要采用形态学观察，这种检测方法费时费力，而且需要专业的分类专家 来区分某些藻类和浮游植物。由于赤潮和绿潮的发生频率和持续周期在全球范围内有所上 升，需要开发新的技术来快速检测有害藻类，各种基于PCR的方法已经开发出来，并在有害 藻类单一物种的鉴别方面显示出其可靠性。但是，具有特定引物的PCR方法在使用时一次只 可以鉴别一种物种，如甲藻。在分析特定样品中的多个藻类物种时，需要借助多个PCR检测 方法才能完成，这使得此类方法有些费时费力。这些成功开发的芯片方法大多数用于产生 赤潮的微藻物种识别。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种涉及检测外来入侵藻类生物的基因芯片； 该基因芯片能快速检测判读多个属或种的入侵藻类生物。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采取的技术方案为:检测外来入侵藻类生物的基因芯 片，包括化学修饰的固相载体，在所述固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，所述检 测探针包括待测塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense);条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum);赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo);东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense);微小原甲藻（Prorocentrum minimum);扁消1 苔（Ulva compressa);米氏凯伦 藻(Karenia mikimotol);石雜属藻(Ulva ohnoi);消1 苔属藻(Ulva prolifera)的特异性 18S序列、28S序列、rbcl序列及ITS序列，所述质控探针为芯片固定阳性对照的核苷酸序列： SEQ ID NO 1所示，芯片杂交阳性对照的核苷酸序列：SEQ ID N0 2所示，芯片杂交阴性对照 的核苷酸序列：SEQ ID N0 3所示，芯片杂交空白对照，塔玛亚历山大藻的检测探针序列为： SEQ ID NO 4、SEQ ID N0 5所示，条纹环沟藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 6、SEQ ID N0 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16所示，赤潮异弯藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31所示，东海原甲藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35所示，微小原甲藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37所示，扁浒苔的检测探针序列为：SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、 SEQ ID NO 40所示，米氏凯伦藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 41所示，石莼属藻的检测探 针序列为：SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43所示，浒苔属藻的检测探针序列为：SEQ ID NO 44、 SEQ ID NO 45所示。
[0005] 上述SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36为18S序列，18S为所有藻类所有，是藻类进化过程中最为保守的基因， 18S基因大小适中，约1.5Kb左右，含有高度保守的基因片段，同时在不同的藻种间也含有变 异的核酸片段。因其既能体现不同藻种之间的差异，又能利用测序技术快速得到核酸序列， 已成为理想的基因鉴定靶序列，具有属或种的特异性。序列SEQ ID NO 12、SEQ ID N0 13、 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38属于28S基 因序列。其广泛存在于外来入侵藻类生物中，在水平层次上无相互转移现象，不随着环境的 变化而变化。序列SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID N0 42属于ITS基因 序列。序列SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45属于rbcL基因。
[0006] 基因芯片用于入侵藻类生物检测的过程由检测系统软件自动检测，使结果分析和 报告输出一体化，达到简便快捷的优点;检测系统软件由博奥生物公司开发提供。
[0007] 与现有技术相比，本发明的优点在于检测外来入侵藻类生物的基因芯片，包括经 化学修饰的固相载体，在固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，检测探针根据塔玛 亚历山大藻、条纹环沟藻、赤潮异弯藻、东海原甲藻、微小原甲藻、扁浒苔、米氏凯伦藻、石莼 属藻、浒苔属藻的特异性18S序列、28S序列、rbcl序列及ITS序列设计的核苷酸序列，该基因 芯片能快速检测判读多个属和种的入侵藻类，因此检测上述藻类快捷和特异;加上检测软 件后就可以自动化检测。因此本发明具有高通量、微型化和自动化检测的优点。
【具体实施方式】
[0008] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009] -、固相载体(基片）的选取：固相载体包括尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、 陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，我们的选择尺寸为75.5mm X 25.2mm X 1.0mm的玻片 作为基片;根据大批量的玻片测定结果和点样仪对点样基片的要求，要求长宽尺寸误差< ±0.2mm，厚度误差< ±0.05mm。同时要求外观无划痕、无缺损。
[0010] 二、基片表面化学修饰:玻片表面要经过化学修饰后，才能牢固地固定DNA，现有的 玻片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。我们选择醛基修饰的醛基基片， 具体制作过程为硅羟基化的玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷处理，使玻片表面带上一层末端 氨基，然后用戊二醛处理，戊二醛分子两端的醛基可以和玻片表面的氨基形成希夫碱，将它 们以长链碳桥的形式连接起来。再用NaBH4或NaCNBH 3还原希夫碱形成稳定的双键。
[0011] 三、醛基基片性能检测:亲疏水性能检测:通过接触角测量仪检测水在基片表面的 接触角情况，接触角在55±5°范围的基片此项检测指标合格。基片背景检测:制备完成后的 基片经晶芯?LuxScan?10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power = 90/900的参数下扫描，其Cy3 通道荧光背景< 1000;其Cy5通道荧光背景< 300为荧光背景合格基片。固定能力的检测:主 要是通过固定在醛基基片表面的激发波长为532nm的焚光标记01 igo样品和要杂交的01 igo 样品分别判断醛基基片的表面化学特性和生物样品固定能力等指标;对于2.5uM激发波长 为532nm的焚光标记Oligo样品，在固定化处理后经晶芯?LuxScan?10K微阵列芯片扫描仪 在PMT/Power = 90/750的参数下扫描，其Cy3通道荧光背景2 10000;且杂交后10.0 uM的PBH (一种Oligo样品)Cy3通道信号2 15000的基片，其固定能力合格。
[0012]四、探针的制备：在芯片设计时采用了SEQ ID N0 1、2、3所示的质控探针，这些探 针均在NCBI中进行了 BLAST比对，和已知基因无明显同源性。从RDPlHhttp:// rdp. cme .msu. edu/)中下载所需要的藻类的核酸序列，分析流程为下载序列数据，整理后导 入数据库，抽取所有外来入侵藻类