肠道病毒荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中肠道病毒核酸存在的试剂 盒，属于肠道病毒的体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒属于单链正股RNA病毒，病毒体呈球型，衣壳为20面体对称结构，无包膜， 具有感染性。在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变。主要经粪一口途径传播，临床表现 多样化，引起人类多种疾病，如脊髓灰质炎、手足口病、麻痹、无菌性脑炎、心肌损伤、腹泻和 皮疹等。
[0003] 人肠道病毒至少由72个血清型组成，其种类有： ① 人脊髓灰质炎病毒1~3型； ② 人柯萨奇病毒A组1~22型和24型(A-23型为埃可病毒9型），B组1~6型； ③ 埃可病毒1~9,11~27,29~34共32个血清型； ④ 新型肠道病毒68~72型，其中1971年分出的70型，能引起急性出血性结膜炎备受重 视，72型为甲型肝炎病毒。轮状病毒、肠道腺病毒。
[0004] 在实验室检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细胞培养和 血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特 异性和敏感性的基础。本发明针对肠道病毒特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用 real-time RT-PCR的方法，用来鉴别检测样品中肠道病毒核酸，可以快速获得特异性检测 结果。
【发明内容】
[0005] 本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在肠道病毒，提供一 种特异性检测肠道病毒的荧光PCR试剂盒。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 一种特异性检测样品中肠道病毒的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控 品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等， 酶混合液主要含有逆转录酶和热启动Taq酶，阴性质控品为无 RNase和DNase水，阳性质控品 为含有肠道病毒检测靶序列的RNA。
[0007] PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对肠道病毒基因组群特 异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物;PCR反应液中用于荧光信号监测的寡 核苷酸探针为Probel、2、3,为针对肠道病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选 出的特异性探针，其中荧光报告基团Χι为FAM，荧光淬灭基团YiSEclipse(见表1)。
[0008] 表1检测肠道病毒的引物和探针序列
本发明的为一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测肠道病毒的应用方法，包括： 试剂盒选用的PCR反应体系为20 μL，包括2XPCR缓冲液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探针0.2 μL、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8 μL、 样品RNA 2 μL，加灭菌水至终体系20 μL。
[0009] 试剂盒的PCR反应循环参数为逆转录阶段:42°C，lOmin;预变性阶段:94°C，lOsec; 预扩增阶段:变性94°C，5sec;退火50°C，20sec;延伸72°C，20sec;共5个循环。注意本阶 段不采集荧光信号。检测阶段:变性94°C，5se C;退火56°C，5〇sec;延伸72°C，15seC;共40 个循环。在退火步骤检测荧光信号。
[0010] 质量控制:每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无 Ct值(或Ct值为0)，阳性对照 Ct值< 30，否则实验结果不成立。
[0011] 结果判读： 阳性：出现"S"型扩增曲线，Ct值< 35;可疑：出现"S"型扩增曲线，但Ct值> 35;阴性:没 有出现"S"型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈"S"型;对可疑结果，应重复实验， 如果重复实验还是出现"S"型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
[0012] 样本要求：临床样本类型包括奠便标本、疱疹液、咽拭子和病毒培养物；临床样本 采集后应带冰运输，-20°C保存，不能反复冻融;从临床样本提取RNA，建议采用性能稳定可 靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的RNA应立即检测，否则， 应将RNA分装后-80°C~_20°C保存。
[0013] 本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出肠道病毒的核酸，但不能检出 非肠道病毒病原体的核酸;对肠道病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时 即可完成检测，可为肠道病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
【附图说明】
[0014] 图1为单重实时荧光PCR检测肠道病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条 曲线分别为肠道病毒体外转录RNA梯度稀释后(2X 106-2X 102 copies/μL)扩增结果。横坐 标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的DRn值。
[0015] 图2为单重实时荧光PCR检测体系对肠道病毒核酸检测特异性扩增曲线图。肠道病 毒出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控毒株均未出现S型扩增曲线。横坐标为反应循 环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的DRn值。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出 的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使 用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人 员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
[0017] 弓丨物和TaqMan探针的设计与合成 利用Blast工具对Genbank和国内外文献中所有的肠道病毒基因组序列进行分析，分别 选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，肠道病毒检测靶序列为5'UTR;并针对这检测靶序 列设计和合成引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中 肠道病毒的检测探针5 '端标记FAM荧光基团，3 '端标记Eel ipse荧光淬灭基团。
[0018] 检测菌种的准备 本实施例中所使用的肠道病毒以及其他阴性对照毒株（腺病毒3型、7型，流感病毒 AH1N1、AH3N2、AH7N9，麻疹病毒，风疹病毒，副流感病毒3型，鼻病毒)均购买于中国药品生物 制品检定所。
[0019] 菌株RNA的抽提 选用德国QIAGEN公司生产的核酸提取或纯化试剂QIAamp DSP Virus Spin Kit (国 械备20140008 QIAGEN GmbH)提取毒株RNA。具体步骤参考试剂盒操作说明书。
[0020] 引物和探针的筛选 采用设计的引物和探针分别检测提取的肠道病毒和阴性对照毒株的基因组RNA，经反 复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合(见序列表，肠道病毒正向引 物P1、反向引物P2和探针Probe 1、2、3 )。
[0021]标准品的构建与制备 分别利用P1、P2引物，RT-PCR扩增肠道病毒特异性基因片段，并克隆至含有T7启动子序 列的质粒(如pGEM-T easy vector)，使用大连宝生物公司的RNA Polymerase，合成RNA，加 入无 RNA酶的胰DNA酶I以终止体外转录反应，通过用酚:氯仿抽提纯化RNA。利用紫外可见分 光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处的吸光率，然后计算RNA浓度与纯度，然后10倍 梯度稀释至200拷贝每微升。
[0022]反应条件优化 对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为:2 X PCR缓冲液10 μ 1、1 Ommo 1 /L dNTP 1.0 μ1、25μπιο1/1引物各0.5 yUlOymol/L探针0.2 μL、逆转录酶和热启动Taq酶混 合液0.8 μL、模板2ul，加灭菌水至终体系20 μL。
[0023]根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应的退火温 度和延伸时间进行了优化，最终确定循环参数为:逆转录阶段:42°C，10min;预变性阶段:94 °(：，1〇86(3 ;预扩增阶段:变性94°(：，586(3;退火50°(：，2〇86(3 ;延伸72°(：，2〇86(3;共5个循环。 注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段:变性94°C，5se C;退火56°C，5〇sec;延伸72°C， 15seC;共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。
[0024]在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
[0025] 检测限的评价 以上述5中的阳性标准品评价本发明提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为:2X lC^copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X104copies/yl、2 X lC^copies/yl、2 X 102copies/yl，本 发明提供的试剂盒对肠道病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系。
[0026] 检测特异性的评价 以上述2中的毒株RNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对肠道病毒RNA进行检测时均 可见明确的扩增曲线，对上述9种其他肠道常见病原微生物RNA检测时，未产生阳性扩增曲 线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他毒株之间不存在交叉反应。
[0027]尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方 式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本 发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如， 本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光 报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如 物;或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧 光双杂交探针等荧光探针标记技术;或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的 基因的存在，进而特异性地检测肠道病毒的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变 和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书 所限定。
[0028
【主权项】
1. 一种用于特异性检测样品中肠道病毒的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴 性质控品和阳性质控品，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下： PI：5'-CCCTGAATGCGGCTAATC-3', P2:5'-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'， PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下： Probe 1:5' -Xi-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Yi-3'， Probe2:5' -Xi-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-Yi-3'， Probe3:5' -Xi-TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC-Yi-3'， Probe荧光报告基团X^FAM，焚光淬灭基团Y^Eclipse。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20 μL，包括2 XPCR缓冲液 10 yl、10mmol/L dNTP 1.0 yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探针0.2 μL、逆转录酶 和热启动Taq酶混合液0.8μ1、样品RNA 2 μL，加灭菌水至终体系20 μL。
【专利摘要】本发明涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中肠道病毒核酸存在的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在肠道病毒核酸，该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的肠道病毒，其检测下限为10拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105624331
【申请号】CN201610019626
【发明人】不公告发明人
【申请人】江苏和创生物科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月13日