蜜蜂以色列急性麻痹病毒rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物检疫技术领域，适用于进出境蜜蜂及其蜜蜂养殖企业以色列急性麻痹病毒的快速检测和监测。
【背景技术】
[0002]2006年冬季到2007年春季，蜂群崩溃失调病(colony collapse disorder，简称CCD)席卷了美国的22个州，随后相继在法国、瑞典、德国和澳大利亚等国家流行，致使当地蜂农蜂群损失达50%?90%。经调查发现以色列急性麻痹病毒(Israel acute paralysisvirus，IAPV)在有CCD症状蜂群里存在的概率为83.3%，而在无CCD症状的蜂群里存在的概率仅为1%，表现出与CCD强烈的相关性，所以目前认定CCD的主要病原为IAPV。
[0003]IAPV是正义单链RNA病毒，具一个无被膜的二十面体蛋白外壳，归属仿小核糖核酸病毒目(picorna-like virus)双顺反子病毒科(Dicistroviridae)成员。IAPV 于2007 年才在以色列被分离鉴定，可侵染各个发育时期的蜜蜂个体(卵、幼虫、蛹、成蜂)和蜂群各级型蜜蜂(工蜂、雄蜂和蜂王)。典型发病症状为患病蜜蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤，逐渐麻痹死亡。病症与蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus，简称ABPV )相似，并且其生物学和系统发育学特性都与ABPV和KBV非常接近，同时与ABPV和蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus，简称KBV)核酸序列还有65%和75%的同源性。
[0004]对IAPV的广泛关注源于2007年CCD爆发期间，当使用用宏基因组方法进行CCD蜂群和正常蜂群间病原物差异的分析后，数据显示IAPV与美国CCD蜂群有强烈的相关性。随后IAPV在欧洲、亚洲和南美洲的多个国家被报道，证实其广泛的自然分布。CCD事件引发了世界范围对因授粉昆虫持续减少现象带来的全球农业授粉危机和生态危机的关注，这一现象与因蜜蜂和蜂产品的国际贸易导致多种蜜蜂病毒广泛传播有关。我国是世界养蜂大国，养蜂数量和蜂产品产量多年来一直稳居世界首位。养蜂业的稳定发展对于促进农民增收、提高农作物产量和维护生态平衡都具有重要意义。
[0005]由于IAPV2007年才被分离鉴定，作为一种新的病毒，人们对其研究较少，目前缺乏完善的诊断技术。本发明将根据蜜蜂IAPV病原学特性，建立该病的诊断措施，在结合临床诊断技术的基础上，应用先进的分子生物学技术，建立以色列急性麻痹病毒RT-PCR实验室检测技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，弥补现有检测技术的不足，其具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，能够对进出境蜜蜂及其蜜蜂养殖过程中以色列急性麻痹病毒进行快速、准确的检疫和鉴定。
[0007]为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下:
1.本发明提供了一种利用RT-PCR方法检测蜜蜂以色列急性麻痹病毒的引物对，所述的引物对序列如下；
正向引物:5 ’ -AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3 ’，
反向引物:5’-TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3’ ；
2.本发明还提供了一种检测蜜蜂以色列急性麻痹病毒的RT-PCR试剂盒，该试剂盒由下列试剂组成:
(I)反转录预混液:每个反应(20yL体系)包括5 X反转录Buffer 4yL;浓度为10 ymol/L的反向引物 1μ?;5 mmol/L的dNTP 2yL；25 mmol/L的MgCl2 2yL；40 U/yL RNA酶抑制因子0.5yL，*9.5yL;
(2沖0?预混液:每个反应(2541^本系)包括2\?0? Buffer 12.5yL;浓度为10 ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL; 5 mmol/L的dNTP lyL；25 mmol/L的MgCl2 2yL，共 16.5yL;
(3)反转录酶:200UAxL;
(4)TaqDNA聚合酶:5 U/yL；
(5)阳性对照:将扩增的目的片段产物连接至克隆载体，转化大肠杆菌制备的感受态细胞获得阳性的克隆菌株；
(6)阴性对照:采用无以色列急性麻痹病毒感染的健康蜜蜂组织提取的总RNA作为阴性对照；
(7)RNase-freeddH20o
[0008]3.上述蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤: (I)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA3yL，RNase-free ddH20 7yL，70 °(:孵育10 min，短暂离心后冰浴5 min，再加入反转录反应液9.5yL和浓度为200 U/yL反转录酶
0.5yL。在42 °C孵育60 min, 95 °C 5 min灭活反转录酶，冰浴5 min，合成cDNA。
[0009](2)PCR反应:在PCR管中加入PCR反应液16.5yL，步骤(I)合成的cDNA3yL，5 U/yL的Taq DNA聚合酶0.5yL，RNase-free ddH20 5yL，总体积为25μΙ^ΡΟ?反应程序:95°C预变性5min;然后95°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，共35个循环；72°C继续延伸10 min，反应结束。
[0010](3)PCR扩增产物电泳检测:取步骤(2)PCR扩增产物1yL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5 V/cm?8V/cm，电泳30min?60min；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果，阳性目的条带大小为270bp。
[0011]本发明的优点和有益效果体现在:(I)良好的稳定性和特异性:对蜜蜂IAPV的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好;2)灵敏度高:灵敏度能达到13拷贝，对于轻度感染、不表现临床症状蜜蜂或携带微量IAPV蜜蜂的检测具有重要应用价值，对该病的早期预防和及时防治具有重要意义；3)操作简便:采用反应预混液，降低污染风险，简化操作步骤，从样品病毒核酸提取至完成检测，耗时不超过5小时。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1的阳性对照重组质粒酶切检测结果。其中M:200bpDNA LadderMarker ； 1:重组质粒Kpn I和EcoRv双酶切；2: EcoRv单酶切;3:重组质粒;4:空质粒;5:空质粒EcoRv单酶切;6:空质粒Kpn I和EcoRv双酶切。
[0013]图2为实施例2的PCR扩增结果。其中M:DNA Marker I; 1:阳性对照;2:阴性对照。
[0014]图3为实施例3的特异性检测结果。其中M:1OObp Ladder DNA marker;A:阴性对照;B:阳性对照；I:以色列急性麻痹病毒(IAPV) ;2:急性麻痹病毒(ABPV) ;3:克什米尔蜜蜂病毒(KBV) ;4:囊状幼虫病毒(SBV) ;5:黑蜂王台病毒(BQCV)。
[0015]图4为实施例4灵敏度检测结果。其中M:100bp Ladder DNA marker; 1:阳性对照；
2: RNA原液;3: 11 稀释;4: 12稀释;5: 13稀释;6: 14稀释;7: 15稀释;8: 16稀释;9: 17稀释；10:1O8稀释;11:1O9稀释;12:1O10稀释;13:阴性对照。
[0016]图5为实施例5的临床样品检测结果:M:1OObp Ladder DNA marker; I?8:不同样品的基因组样品；9:阴性对照；10:阳性对照。
【具体实施方式】
[0017]为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0018]实施例1:
一种检测蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR试剂盒，包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为5’-AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3’，反向引物序列为5’-TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3’ ；该试剂盒包括下列试剂(30个反应体系):
(I)反转录预混液:每个反应(20yL体系)包括5 X反转录Buffer 4yL;浓度为10 ymol/L的反向引物lyL;5 mmol/L的dNTP 2yL；25 mmol/L的MgCl2 2yL；40 U/yL RNA酶抑制因子
0.5yL，共9.5yL，30个反应体系共计285yL，-20 °C保存备用。
[0019](2)PCR预混液:每个反应(25yL体系)包括2XPCR Buffer 12.5yL;浓度为10 μmol/L的正向引物和反向引物各0.5yL; 5 mmol/L的dNTP lyL；25 mmol/L的MgCl2 2yL，共16.541^，3