0个反应体系共计49541^，-20°(:保存备用。
[0020](3)反转录酶:200 U/yL，lX15yL/管，-20°C保存备用。
[0021](4)Taq DNA聚合酶:5 U/yL，I X 15yL/管，_20°C保存备用。
[0022](5)阳性对照:将扩增的目的片段产物连接至克隆载体，转化大肠杆菌制备的感受态细胞获得阳性的克隆菌株，I X 50yL/管，_20°C保存备用。
[0023](6)阴性对照:采用无以色列急性麻痹病毒感染的健康蜜蜂组织提取的总RNA作为阴性对照，I X 50μ?ν管，-20 0C保存备用。
[0024](7)RNase-free ddH20:1 X 2mL/管。
[0025]实施例2:
蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
(I)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA3yL，RNase-free ddH20 7yL，70 °(:孵育10 min，短暂离心后冰浴5 min，再加入反转录反应液9.5yL和浓度为200 U/yL反转录酶
0.5yL。在42 °C孵育60 min, 95 °C 5 min灭活反转录酶，冰浴5 min，合成cDNA。
[0026](2)PCR反应:在PCR管中加入PCR反应液16.5yL，步骤(I)合成的cDNA3yL，5 U/yL的Taq DNA聚合酶0.5yL，RNase-free ddH20 5yL，总体积为25μΙ^ΡΟ?反应程序:95°C预变性5min;然后95°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，共35个循环；72°C继续延伸10 min，反应结束。
[0027](3)PCR扩增产物电泳检测:取步骤(2)PCR扩增产物1yL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5 V/cm?8V/cm，电泳30min?60min；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。阳性样品电泳检测结果为在270bp处出现明亮的DNA条带(图2)，阴性则无。
[0028]实施例3:蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的特异性测定
(I)蜜蜂样品总RNA的提取:分别以携带有以色列急性麻痹病毒(IAPV)、急性麻痹病毒(ABPV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、囊状幼虫病毒(SBV)和黑蜂王台病毒(BQCV)的蜜蜂样品为材料，各取0.1g置于灭菌研钵中，加入I mL PBS缓冲液研磨，4°C，10 OOOg离心5min，取上清迅速转移至灭菌的1.5 mL离心管中，加入I mL Trizol试剂，剧烈震荡15s，室温静置5min; 4 °C，12 OOOg离心1min，取上清移入到另一灭菌的1.5 mL离心管中；加入氯仿300yL，剧烈震荡15s，室温静置5min;4°C，12 OOOg离心15min，取上层水相移入到另一灭菌的1.5mL离心管中；加入等体积的异丙醇，颠倒混勾后室温静置5min;4°C，12 OOOg离心1min，弃上清;加入600yL75%的乙醇洗涤沉淀，4°C，12 OOOg离心1min，弃上清;RNA沉淀干燥后，用1yL RNase-free ddifeO溶解备用。
[0029](2)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA3yL，RNase-free ddH20 7yL，70°C孵育10 min，短暂离心后冰浴5 min，再加入反转录反应液9.5yL和浓度为200 UAiLiR录酶0.5yL。在42 °C孵育60 min, 95 °C 5 min灭活反转录酶，冰浴5 min，合成cDNA。
[0030](3)PCR反应:在PCR管中加入PCR反应液16.5yL，步骤(2)合成的cDNA3yL，5 U/yL的Taq DNA聚合酶0.5yL，RNase-free ddH20 5yL，总体积为25μΙ^ΡΟ?反应程序:95°C预变性5min;然后95°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，共35个循环；72°C继续延伸10 min，反应结束。
[0031 ] (4)PCR扩增产物电泳检测:取步骤(3)PCR扩增产物1yL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5 V/cm?8V/cm，电泳30min?60min；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。由图3可知，仅以色列急性麻痹病毒样品和阳性对照在270bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品和阴性对照均无，说明本发明的试剂盒具有很强的特异性。
[0032]实施例4:蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的灵敏性测定
将蜜蜂以色列急性麻痹病毒样品的RNA从11到11t3 10倍递增稀释，作为模板，按照实施例2的方法进行检测，从图4可知，15稀释的RNA样品仍有明亮的DNA条带，说明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。
[0033]实施例5:临床样品以色列急性麻痹病毒的检测
选取8份来自不同养蜂场的蜜蜂样品，分别提取各个样品的RNA后按按照实施例2的方法进行检测。结果如图5所示，样品3、6、8为阳性，其余为阴性，检出率为37.5%。
[0034]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为5 ’ -AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3 ’，反向引物序列为5 ’ -TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3，。2.根据权利要求1的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒由下列试剂组成: (1)反转录预混液:，每个20yL反应体系包括5X反转录Buffer 4yL;浓度为10 ymol/L的反向引物 1μ?;5 mmol/L的dNTP 2yL；25 mmol/L的MgCl2 2yL；40 U/yL RNA酶抑制因子0.5yL，*9.5yL; (2沖0?预混液:每个2541^反应体系包括2\?0? Buffer 12.5yL;浓度为10 ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL; 5 mmol/L的dNTP lyL；25 mmol/L的MgCl2 2yL，共 16.5yL; (3)反转录酶:200UAxL; (4)TaqDNA聚合酶:5 U/yL； (5)阳性对照:将扩增的目的片段产物连接至克隆载体，转化大肠杆菌制备的感受态细胞获得阳性的克隆菌株； (6)阴性对照:采用无以色列急性麻痹病毒感染的健康蜜蜂组织提取的总RNA作为阴性对照；(7)RNase-freeddH20o3.利用权利要求1或2所述的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)反转录反应:在PCR管中加入待测样品总RNA3yL，RNase-freeddH20 7yL，70 °(:孵育10 min，短暂离心后冰浴5 min，再加入反转录反应液9.5yL和浓度为200 U/yL反转录酶.0.5yL;在42 °C孵育60 min, 95 °C 5 min灭活反转录酶，冰浴5 min，合成cDNA; (2)PCR反应:在PCR管中加入PCR反应液16.5yL，步骤(I)合成的cDNA3yL，5U/yL的TaqDNA聚合酶0.5yL，RNase-free ddH20 5yL，总体积为25yL;PCR反应程序:95°C预变性5 min；然后95°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，共35个循环；72°C继续延伸10 min，反应结束； (3)PCR扩增产物电泳检测:取步骤(2)PCR扩增产物1yL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5 V/cm?8V/cm，电泳30min?60min ；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果，阳性目的条带大小为270 bp ο
【专利摘要】本发明涉及蜜蜂以色列急性麻痹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测。该试剂盒包括：（1）反转录预混液；（2）PCR预混液；（3）反转录酶；（4）Taq？DNA聚合酶；（5）阳性对照；（6）阴性对照；（7）RNase-free？ddH2O。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜜蜂IAPV的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；2）灵敏度高：灵敏度能达到103拷贝；3）操作简便：采用反应预混液，减少操作步骤，降低污染风险。本方法可用于蜜蜂的IAPV感染检测，对该病的早期预防和及时防治具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105624334
【申请号】CN201610134738
【发明人】张体银, 郑腾, 蔡一龙, 白泉阳, 王武军, 张志灯, 于师宇
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年4月18日