猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧光 定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV)，也称为非洲绿猴病毒 (African Green Monkey virus)，是一种可影响至少33种非洲灵长目的逆转录病毒。SIV与 与HIV病毒在基因序列上有较高的同源性，非人灵长类感染SIV后，出现类似AIDS的发病机 制和临床症状表现，可在感染病毒后出现免疫系统的损害和多系统多器官组织的病变，SIV 在恒河猴体内分布较为广泛，可累及包括免疫系统在内的多个系统。
[0003] 猴D型反转录病毒(simian type-Dretro virus，SRV)属反转录病毒科、D型反转录 病毒属，与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)同为猴获得性免疫缺 陷综合征（SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有5个血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主 要的靶细胞是淋巴细胞，感染后可造成淋巴细胞耗竭，诱发免疫缺陷。各型SRV的发生有其 种属性和群体性，一旦传入易感猴群，可使80%以上的猴发病致死。
[0004] 猴T淋巴细胞白血病病毒（simian T-lymphotropic virus，STLVl)，与人T淋巴白 血病病毒(human T-lymphotropic virus，HTLV)统称为灵长类嗜T淋巴细胞病毒(primate T-lymphotropic virus，PTLV)，均属于逆转录病毒属。猴T淋巴细胞趋向性病毒最初从亚洲 和非洲猴体内分离到，人工繁殖猴和野生猴均可被STLV1感染，但无临床症状表现。受STLV1 感染的非洲绿猴出现了与受HTLV感染的人相似的贫血症，并且STLV1与人的HTLV的遗传同 源性高达90-95%，有研究证明我国野生和饲养恒河猴血清广泛存在STLV1抗体。STLV1病毒 主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊乱，从而干扰实验研究，是SPF 猴必须排除的几种病毒之一。
[0005] 多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在 同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒 检测领域。Weyer CT等建立了对非洲马瘟9种血清型分子分型的定性检测的三重实时荧光 PCR方法;Haines FJ等建立了同时检测古典猪瘟和非洲猪瘟多重实时荧光RT-PCR方法;许 建明等建立了同时检测三种鱼类弹状病毒的三重实时荧光PCR方法，结果显示多重PCR体系 与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。但是到目前为止，尚无报道有同时检测 SIV、SRV1和STLV1的试剂盒。
[0006] 对于逆转录病毒而言，被该类病毒感染的动物常产生免疫抑制，导致血清中特异 性抗体水平偏低，造成抗体检测出现假阴性现象，实时定量PCR通过直接对感染动物的病原 体核酸特定片段进行扩增，检测扩增中荧光信号的强度变化，从而达到检测目的。该方法的 优势在于，直接对逆转录病毒的核酸进行检测，提高了检测的特异性;而对于逆转录病毒核 酸特定片段的扩增和放大，提高了检测的敏感性。
[0007] 根据靶基因种内高度保守、种间高度特异的选择原则，经过序列BLAST比对分析， SIV的gag基因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因作为检测靶基因的理想候选者。本发明 选取这三种基因作为靶基因，设计引物和探针，对设计的多对引物探针组合进行实验筛选 优化，获得最佳引物探针组合，建立了三重实时荧光PCR检测方法。
【发明内容】
[0008] 基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧 光定量PCR检测方法及其专用引物、探针和基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于 猴逆转录病毒的检测。具体涉及同时检测实验猴的猴免疫缺陷病毒（SIV)、猴逆转录病毒 (SRV1)和猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(STLV1)。
[0009] 一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法所需引物对 及探针，
[0010] 猴免疫缺陷病毒siv:
[0011] 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示，
[0012] 下引物SI-R:如序列表Seq.N〇2所示，
[0013] 探针SI-P:如序列表Seq.N〇3所示；
[0014] 猴逆转D型病毒SRV1:
[0015] 上引物SR-F:如序列表Seq.No4所示，
[0016] 下引物SR-R:如序列表Seq · No5所示，
[0017] 探针SR-P:如序列表Seq.No6所示；
[0018] 猴T淋巴细胞趋向性病毒I型STLV1:
[0019] 上引物ST-F:如序列表Seq.No7所示，
[0020] 下引物ST-R:如序列表Seq · No8所示，
[0021] 探针ST-P:如序列表Seq.No9所示。
[0022] 本发明还具有如下技术特征：
[0023] 1、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法阳性对照 品的制备方法，包括如下步骤，
[0024] 步骤(l)PCR模板的制备:SIV、SRV1、STLV1保守区基因序列的合成。
[0025] 步骤(2)以步骤(1)中合成的各序列为模板，分别以上引物SI-F、下引物SI-R，上引 物SR-F、下引物SR-R，上引物ST-F、下引物ST-R为引物，进行目的基因的PCR扩增；
[0026] 步骤(3)阳性对照品pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl的制备：
[0027]步骤(2)中，目的基因的PCR反应体系如下：
[0028] 引物各2yL，2XTaq MasterMix 15yL，模板5yL，超纯水补足至30yL。
[0029] PCR的反应条件为：反转录 5〇￡€3〇11^11;951€51^11热启动，95°(：158,55 1€258,72°(：延 伸15s，共进行40个循环;72°C延伸lOmin;
[0030] 步骤(3)中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤:将步骤(2)中所得PCR产物分 别与克隆载体pMD-18-T vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5a，获得阳性克隆菌株，并制 备质粒 pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl 作为阳性对照品。
[0031] 2、如上所述一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的阳性对照 品，PMD18-SIV，如序列表569.勖10所示4]\?)18-51^1，如序列表569.化11所示$]\0)18- STLV1，如序列表Seq.Nol2所示。
[0032] 3、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法，PCR反应 体系如下：
[0033] RT-PCR反应液12.5yL，Taq酶0 · 5yL，RTMIX 0 · 5yL，引物混合液（200nmol/L，分别包 含三种病毒的特异性引物比例为1:1:1)共3此，探针混合液（100nm 〇l/L，分别包含三种病毒 的特异性荧光探针，比例为1:1:1)共3yL，提取的样本核酸5yL作为反应模板，去RNAase Free水补足至25yL;
[0034] PCR 的反应条件为：反转录 5〇￡€3〇!1^11;951€51^11热启动，之后以95°(：158,55 1€258， 共进行40个循环。
[0035] 4、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测用试剂盒，包 括试剂如下，
[0036]引物对及探针：
[0037] 猴免疫缺陷病毒SIV:
[0038] 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示，
[0039] 下引物SI-R:如序列表Seq.N〇2所示，
[0040] 探针SI-P:如序列表Seq.N〇3所示；
[0041 ] 猴逆转D型病毒SRV1:
[0042] 上引物SR-F:如序列表Seq · No4所示，
[0043] 下引物SR-R:如序列表Seq.No5所示，
[0044] 探针SR-P:如序列表Seq.No6所示；
[0045] 猴T淋巴细胞趋向性病毒I型STLV1:
[0046] 上引物ST-F:如序列表Seq · No7所示，
[0047] 下引物ST-R:如序列表Seq. No8所示，
[0048] 探针ST-P:如序列表Seq.No9所示；
[0049] 阳性对照品：
[0050] PMD18-SIV，如序列表 Seq.NolO 所示，
[0051] ?]\?)18-51^1:如序列表569.吣11所示，
[0052] pMD18-STLVl:如序列表 Seq.Nol2 所示；
[0053]阴性对照品ddH20、病毒核酸DNA/RAN提取试剂、实时荧光定量PCR扩增所需的RT-PCR预混液和Taq酶。
[0054]本发明的优势在于，能同时检测SIV、SRV1和STLV1三种病毒，直接对逆转录病毒的 核酸进行检测，提高了检测的特异性;而对于逆转录病毒核酸特定片段的扩增和放大，提高 了检测的敏感性。
【附图说明】
[0055]图1为三种重组阳性质粒PCR鉴定结果图。
[0056]图2为SIV病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
[0057]图3为SRV1病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
[0058]图4为STLV1病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
[0059] 图5为SIV三重qRT-PCR敏感性试验结果图。
[0060] 图6为SRV1三重qRT-PCR敏感性试验结果图。
[0061 ] 图7为STLV1三重qRT-PCR敏感性试验结果图。
[0062] 图8为SIV、SRV1和STLV1三重qRT-PCR特异性试验结果图。
【具体实施方式】
[0063]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0064] 实施例1
[0065] 目的基因的合成
[0066]根据GenBank公布的三种病毒中的序列，结合生物信息学手段，确定以SIV的gag基 因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因保守区序列作为检测靶序列，合成其DNA片段，基因 合成由上海生工生物工程技术服务完成。病毒基因序列如表1所示。
[0067] 表1:三种病毒的DNA序列
[0068]
[0069] 实施例2 [0070]特异性引物的合成
[0071]根据合成的三种病毒的基因序列，合成特异性引物，序列如表2所示。
[0072]表2:特异性引物序列
[0073]
[0074] 实施例3
[0075] 阳性质粒的制备
[0076] 1、PCR扩增目的基因
[0077] (1)扩增 SIV 基因：
[0078] PCR反应体系：引物各2yL，2XTaq MasterMix 15yL，模板5yL，超纯水补足至30yL。
[0079] PCR 的反应条件为：反转录 5〇￡€3〇!1^11;951€51^11热启动，之后以95°(：158,55 1€258， 72°C延伸15s，共进行40个循环;72°C延伸lOmin。
[0080] (2)SRV1、STLV基因的扩增