检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于靶DNA片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测中华鳖细小病毒 的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 中华鳖细小病毒（Trionyx sinensis Dependoparvovirus，TSDPV)是引起中华鳖 大量死亡的致病性病毒，常引起中华鳖肝炎、肠道卡他性炎症和胰脏点状坏死，对中华鳖养 殖产业危害极大。TSDPV为单链DNA病毒，属于细小病毒目细小病毒科细小病毒亚科依赖性 细小病毒属，该病毒是目前发现能够感染中华鳖的第二个DNA病毒。该病毒于2012年从患肝 炎和肠炎的中华鳖中分离获得，其造成中华鳖在养殖期大量死亡，死亡率一般为60~70%， 严重的达到85%以上，近几年造成的经济损失无法估量。该病毒在国内外未见报道，由于该 病毒至今未有检测试剂盒和检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病 毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物、 探针及快速检测试剂盒，本发明的引物、探针和试剂盒特异性强，敏感性高，能实现快速、有 效且准确检测中华鳖细小病毒;本发明中的两种试剂盒分别为链置换等温扩增可视化快速 检测试剂盒和荧光定量检测试剂盒，两种试剂盒都是在封闭的情况下判断结果，扩增产物 不会对检测环境造成污染，可用于中华鳖细小病毒病的监测和早期预防。本发明采用链置 换酶、等温扩增和荧光定量技术，通过检测中华鳖细小病毒的衣壳蛋白基因，来检测中华鳖 细小病毒，这是目前国内外首次研制检测中华鳖细小病毒的试剂盒;该试剂盒的研制为中 华鳖细小病毒病的监测和预防奠定基础。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物组 A，该引物组A包含引物TSDPV-F3、引物TSDPV-B3、引物TSDPV-FIP和引物TSDPV-BIP，
[0005] 引物TSDPV-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；
[0006] 引物TSDPV-B3的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示；
[0007] 引物TSDPV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0008] 引物TSDPV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0009] 本发明还公开了一种检测中华鳖细小病毒的引物探针混合物，其由引物组B和 Taqman荧光探针C组成，探针C的5'端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团。
[0010] 进一步地，引物组B包含引物TSDPV-q 165F和引物TSDPV-q 165R;
[0011] 引物TSDPV-ql65F的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示；
[0012] 引物TSDPV-ql65R的核苷酸序列如SEQIDN0:6所示；
[0013] 探针的C的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。
[0014] 进一步地，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、 四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4'，5'_二 氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几 种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞 淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一种或几种。
[0015] 本发明还公开了一种中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，包 括病毒DNA提取试剂和反应试剂。
[0016] 病毒DNA提取试剂包含以下组分:成分为lOOmM Tris、50mM EDTA、500mM NaCl、2% SDS、1 ΟπιΜβ-巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A;乙酸钾水溶液，浓度5M;无水乙醇;DEPC水配置的 含75 %无水乙醇的洗液A; DEPC水。
[0017] 反应试剂包括以下组分：
[0018] 1)预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HCl、8mM硫酸镁、14mM氯化钾、10mM硫酸按、 0 · 12 % Tween-20、1 · 4mM dNTP、0 · 6M甜菜碱、0 · 15~0 · 25μΜ引物TSDPV-F3、0 · 15~0 · 25μΜ引 物TSDPV-B3、1 · 6~2 · ΟμΜ引物TSDPV-FIP和 1 · 6~2 · ΟμΜ引物TSDPV-BIP;
[0019] 2)反应酶:每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；
[0020] 3)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；
[0021] 4)反应显色液:含有10%SYBR Green I的荧光染料。
[0022] 本发明还公开了一种上述中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂 盒在检测中华鳖细小病毒基因中的应用，包括以下步骤：
[0023] 1)DNA抽提:取中华鳖肝脏或脾脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，采用病毒DNA提 取试剂进行DNA提取；
[0024] 2)中华鳖细小病毒基因扩增：
[0025] ①根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N =样品数+2,其中1管为阳性对 照，1管为阴性对照；
[0026]②吸取所述的预反应液的体积为NX 23yL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加 入NyL反应酶，混合均匀，1500~2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；
[0027]③向设定的N个反应管中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管， 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL;
[0028]④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标 记，2000转/分钟离心5秒；
[0029] ⑤在63°C下恒温反应60分钟；
[0030] 3)显色检测：
[0031] 取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检 样品和阳性对照的顺序依次分别加入1 uL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变 化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。
[0032] 本发明还公开了一种中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒，包括特异性引物组B 和Taqman荧光探针C。
[0033] 进一步地，Taqman荧光探针C核苷酸序列5 '端标记6-FAM，3 '端标记BHQ1。
[0034]进一步地，该试剂盒还包括独立包装的病毒裂解液、PCR反应液、阳性质控品、阴性 质控品，其中病毒裂解液为含有10mM Tris、1.OmM EDTA，pH8.0的缓冲液，PCR反应液为探针 法荧光定量PCR反应液，阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有中华鳖细小病毒衣 壳蛋白基因的载体。
[0035] 本发明还公开了 一种由上述检测中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒在检测中 华鳖细小病毒中的应用，包括以下步骤：
[0036] 待检样品使用病毒裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到引物探针混合液， 再加入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为95 °C条件下反应5-10分钟;然后95 °C反应5-15秒，60 °C反应20-30秒，共38-42个循环;荧光信号收集时设定为FAM，荧光信号收 集设在60°C;
[0037] 结果判断：如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为中华鳖细小病毒阴性;如果 检测通道出现S型扩增曲线，Ct值<35,则中华鳖细小病毒别判定为阳性。
[0038] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0039] 1)本发明根据靶基因序列设计了中华鳖细小病毒检测用引物组，能特异性识别靶 序列上的六个独立区域，在BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的作用下启动循环链置换反应，在 靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的 茎一环DNA混合物，由于快速技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才 能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了 中华鳖细小病毒检测的特异性；
[0040] 2)采用本发明的引物组对中华鳖细小病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根 据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；
[0041] 3)本发明的快速诊断试剂盒是利用链置换酶和等温扩增技术快速检测中华鳖细 小病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需12病毒拷贝；
[0042] 4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊 试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；
[0043] 5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到lh即可完成扩增，且产率高；
[0044] 6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中 的Mg2+结合，产生副产物一一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳 性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；
[0045] 7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立 成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；
[0046] 8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的链置换等温扩增反应体系，不 但使得中