;35,则中华鳖细小病毒别判定为阳性。
[0101] 本发明所述的引物组A是在获得中华鳖细小病毒基因组序列的基础上，根据链置 换酶的特点进行设计的，设计的引物组分别结合目的基因六个区段，大大增加了特异性，并 利用反应中产生的茎环结构重新为模版，极显著增加了扩增效率和扩增产物。所述的引物 组B和探针是针对中华鳖细小病毒衣壳蛋白基因进行设计的，采用特异性探针的荧光基团 捕获来进行结果检测，具有灵敏度高，使用方便的特点，也是国际检测用试剂盒的通用标 准。
[0102] 实施例6中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒的应用例
[0103] (l)DNA 抽提：
[0104] 取中华鳖肝脏或脾脏组织10-20mg于1.5mL离心管中，加入500yL灭菌生理盐水混 匀用研磨棒研磨粉碎后，12000rpm离心2分钟;再用灭菌生理盐水重复洗涤一次;去尽上清， 沉淀中加入l〇〇yL裂解液充分混匀，100°C作用10分钟后，冰冷5分钟，12000rpm离心10分钟， 上清即为纯化的病毒核酸，作为待检模板。
[0105] (2)荧光定量 PCR:
[0106] 在9个反应管中分别加入PCR反应液14.5yL，引物探针混合液5.5yL配制成反应体 系，然后分别加入5. OyL待检模板。
[0107] 荧光定量PCR反应条件：37°C，2分钟；95°C，3分钟；94°C，15秒;60 °C，45秒，40个循 环。
[0108] 采用LightCycler 96 System荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素， 焚光信号收集设在60°C。
[0109] 每批次反应均设置阴性质控品（灭菌生理盐水）、阳性质控品（中华鳖细小病毒假 病毒）。
[0110] (3)结果判断:检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为中华鳖细小病毒阴性;如果 检测通道出现S型扩增曲线，Ct值<35,则中华鳖细小病毒别判定为阳性。
[0111] 结果验证:将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果应与中华鳖细小病毒 衣壳蛋白基因序列一致。
[0112] 采用上述中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒和方法进行快速检测中华鳖细小 病毒灵敏性试验结果如附图3所示。
[0113] 图3中华鳖细小病毒灵敏性检测图，如图所示，经Real-time PCR定量后的中华鳖 细小病毒DNA系列稀释的扩增图，当反应体系中加入12个病毒拷贝的DNA，扩增显色结果就 为阳性。
[0114] 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改 和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行 改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测中华鳖细小病毒的特异性引物组A，其特征在于，该引物组A包含引物TSDPV-F3、 引物TSDPV-B3、引物TSDPV-FIP和引物TSDPV-BIP， 所述的引物TSDPV-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示； 所述的引物TSDPV-B3的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 所述的引物TSDPV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 所述的引物TSDPV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。2. 检测中华鳖细小病毒的引物探针混合物，其特征在于，其由引物组B和Taqman荧光探 针C组成，Taqman焚光探针C的5 '端标记有焚光报告基团，3 '端标记有焚光淬灭基团。3. 根据权利要求2所述的引物探针混合物，其特征在于，所述引物组B包含引物TSDPV-ql65F和引物 TSDPV_ql65R; 所述的引物TSDPV-ql65F的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示； 所述的引物TSDPV-ql65R的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 所述Taqman荧光探针C的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。4. 根据权利要求2所述的引物探针混合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自6-羧基 荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四 甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4 '，5 二氯-2 '，7 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁 3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹 明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一 种或几种。5. -种中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括病 毒DNA提取试剂和反应试剂。6. 根据权利要求5所述的中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，其 特征在于，所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分:成分为100mM Tris、50mM EDTA、500mM NaCl、2 % SDS、1 ΟπιΜβ-巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A;乙酸钾水溶液，浓度5M;无水乙醇;DEPC 水配置的含75 %无水乙醇的洗液A; DEPC水。7. 根据权利要求5所述的中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，其 特征在于，所述的反应试剂包括以下组分： 1) 预反应液:20mM pH为8.8的Tr i s-HCl、8mM硫酸镁、14mM氯化钾、10mM硫酸按、0.12 % Tween-20、1.4mM dNTP、0.6M甜菜碱、0· 15~0·25μΜ引物TSDPV-F3、0.15~0·25μΜ引物 TSDPV-B3、1 · 6~2 · ΟμΜ引物TSDPV-FIP和 1 · 6~2 · ΟμΜ引物TSDPV-BIP; 2) 反应酶:每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶； 3) 反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成； 4) 反应显色液:含有10 % SYBR Green I的荧光染料。8. -种权利要求5所述的中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒在检 测中华鳖细小病毒基因中的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1. DNA抽提:取中华鳖肝脏或脾脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，采用病毒DNA提取试 剂进行DNA提取； 2) 中华鳖细小病毒基因扩增： ①根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N =样品数+2,其中1管为阳性对照，1 管为阴性对照； ② 吸取所述的预反应液的体积为NX 23yL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NyL 反应酶，混合均匀，1500~2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液； ③ 向设定的N个反应管中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上 述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL; ④ 在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记， 2000转/分钟离心5秒； ⑤ 在63 °C下丨旦温反应60分钟； 3)显色检测： 取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品 和阳性对照的顺序依次分别加入1 uL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿 色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。9. 一种中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒，其特征在于，包括特异性引物组B和 Taqman焚光探针C。10. 根据权利要求9所述的检测中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒，其特征在于， Taqman荧光探针C核苷酸序列5 '端标记6-FAM，3 '端标记BHQ1。11. 根据权利要求9所述的检测中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒，其特征在于，该 试剂盒还包括独立包装的病毒裂解液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品，其中病毒裂解 液为含有l〇mM Tris、1.0mM EDTA，pH8.0的缓冲液，PCR反应液为探针法荧光定量PCR反应 液，阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有中华鳖细小病毒衣壳蛋白基因的载体。12. -种由权利要求9所述的检测中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒在检测中华鳖 细小病毒中的应用，其特征在于，包括以下步骤： 待检样品使用病毒裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到引物探针混合液，再加 入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为95°C条件下反应5-10分钟;然后95°C反 应5-15秒，60°C反应20-30秒，共38-42个循环;荧光信号收集时设定为FAM，荧光信号收集设 在 60。。； 结果判断：如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为中华鳖细小病毒阴性;如果检测 通道出现S型扩增曲线，Ct值<35,则中华鳖细小病毒别判定为阳性。
【专利摘要】本发明公开了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，其中，中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒包含引物组A，中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒包括特异性引物组B和Taqman荧光探针C；本发明采用链置换酶、等温扩增和荧光定量技术，通过检测中华鳖细小病毒的衣壳蛋白基因，来检测中华鳖细小病毒，这是目前国内外首次研制检测中华鳖细小病毒的引物组和试剂盒。该试剂盒的研制为中华鳖细小病毒病的监测和预防奠定基础。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105624336
【申请号】CN201610216402
【发明人】潘晓艺, 袁雪梅, 沈锦玉, 蔺凌云, 姚嘉赟, 徐洋, 尹文林
【申请人】浙江省淡水水产研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年4月8日