筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法

筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：（1）将基因甲插入表达质粒后转化宿主菌，得到野生菌；将基因甲作为模板进行易错PCR，将易错PCR的产物插入表达质粒后转化所述宿主菌，得到的所有单菌落组成突变菌株库；基因甲为已知的具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的蛋白质的编码基因；（2）将野生菌和突变菌株库中的每个菌分别进行培养并收集发酵产物；（3）将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液；（4）采用DNS法筛选；（5）进行（a）和/或（b）；（a）薄层层析；（b）HPLC。本发明具有高效、快速、具有高通量等优点。
【专利说明】筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能 力的菌株的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的 菌株的方法。

【背景技术】
[0002] 人参是传统的中医药材。据现代药理研究报道，人参具有增强人体免疫力，改善营 养、抗衰老和减缓疲劳等功效。研究发现一些稀有人参皂苷(如人参皂苷Rg 3、人参皂苷Rh2、 人参阜苷Compound K等）具有高生物活性，更易于被人体吸收，具有促进恶性肿瘤细胞衰 亡、遏制肿瘤扩散或恶化等医疗功效，有较高的生产价值和应用前景。
[0003] 稀有人参阜苷在天然的人参提取物中含量较低或者不存在。体外制备稀有人参 皂苷的方法通常有化学法和生物转化法，主要是将大量存在的人参皂苷成分(如人参皂苷 Rbi、人参皂苷Rb2等）的特定位点的葡萄糖基或阿拉伯糖基等水解除去，从而生成稀有人参 皂苷。化学法(如酸水解或碱水解)催化缺乏专一性，终产物合成效率很低。生物转化法(特 别是酶法）不仅反应条件温和、反应专一性强，而且得率较高、污染小，因此成为稀有人参皂 苷工业化生产的发展方向。现有的生物转化生产稀有人参皂苷的方法的转化效率尚需要进 一步提高，才能满足工业生产的需求。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷 的能力的菌株的方法。
[0005] 本发明提供了一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力 的菌株的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)将基因甲插入表达质粒的多克隆位点后转化宿主菌，得到野生菌；将基因甲 或含有所述基因甲的质粒作为模板并将所述基因甲作为靶区域进行易错PCR，将所述易错 PCR的产物插入所述表达质粒的多克隆位点后转化所述宿主菌，得到的所有单菌落组成突 变菌株库；所述基因甲为已知的具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的 蛋白质的编码基因；
[0007] (2)将野生菌和突变菌株库中的每个菌分别进行培养并收集发酵产物；
[0008] (3)将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液；
[0009] (4)采用DNS法检测步骤（3)得到的反应液中的还原糖含量，测量0D54(lnm吸光值； 对于突变菌株库中的每个菌来说，如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液的0D 54tol吸光值 大于野生菌进行步骤（3)得到的反应液的0D54(tam吸光值，该菌株即为本步骤筛选得到的菌 株；
[0010] (5)进行（a)和 / 或（b);
[0011] (a)将野生菌和步骤（4)筛选得到的菌株进行步骤（3)得到的反应液进行薄层层 析；对于步骤（4)筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液中稀有人参 皂苷的含量高于野生菌进行步骤（3)得到的反应液中稀有人参皂苷的含量，该菌株即为本 步骤筛选得到的菌株；
[0012] (b)将野生菌和步骤（4)筛选得到的菌株进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所 述大量存在的人参皂苷，然后用有机溶剂抽提，然后进行HPLC ;对于步骤（4)筛选得到的菌 株来说，如果某个菌进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后稀有 人参皂苷的产量高于野生菌进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷 后稀有人参皂苷的产量，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株。
[0013] 所述大量存在的人参皂苷具体可为人参皂苷Rbi。
[0014] 所述稀有人参皂苷具体可为人参皂苷compound K。
[0015] 所述基因甲可为编码β -糖苷酶的基因。所述基因甲具体可为编码硫磺矿硫化叶 菌的β-糖苷酶的基因。所述基因甲具体可为编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。所 述基因甲具体可如序列表的序列2所示。
[0016] 所述表达质粒具体可为pET-28a(+)载体。所述宿主菌具体可为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0017] 所述步骤（2)中，所述"培养"的方法具体如下：在培养体系中加入IPTG进行诱导。 所述步骤（2)中，所述"培养"的方法具体如下：签挑取单菌落至800μ 1含50μ g/mL卡那 霉素的LB液体培养基，37°C、750rpm振荡培养24h，得到种子液；将5 μ 1所述种子液转接入 800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基，加入诱导剂IPTG至其浓度为0. ImM，然后在 30°C、750rpm振荡培养24h (此时0D6(l(lnm约为2. 5)。所述步骤（2)中，所述"发酵产物"为整 个发酵体系、发酵上清或菌体破碎液。所述菌体破碎液菌体可为将所述发酵体系中的菌体 进行破壁后得到的上清液。所述菌体破碎液具体可按如下方法制备：取完成所述培养的整 个的发酵体系，离心(离心条件具体可为3000g、10min)并收集菌体，将菌体置于-80°C放置 30min后室温融化，随后加入300 μ 1浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液(溶剂具体可为pH8. 0、 50mM的Tris-HCl缓冲液)，37°C、750rpm振荡反应lh，3000g离心lOmin并收集上清液，即 为菌体破碎液。
[0018] 所述步骤（3)中，所述"将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷"的方法 如下：将所述发酵产物和含有大量存在的人参皂苷的溶液混匀，85°C静置30min后即刻置 于冰上冷却。具体可将100 μ 1所述菌体破碎液与200 μ 1含有lmg/ml人参皂苷Rh的溶液 (溶剂具体可为PH5. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为200mM、柠檬 酸浓度为l〇〇mM)混匀。
[0019] 所述步骤（4)中，所述"采用DNS法检测步骤（3)得到的反应液中的还原糖含量" 的方法如下：在步骤（3)得到的反应液中加入900μ 1 DNS溶液，85°C水浴静置7min显色。
[0020] 所述（a)中，所述薄层层析的展层剂如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (体积比)。人 参阜苷 compound K 的 Rf 值=0· 85。
[0021] 所述（b)中，所述有机溶剂可为正丁醇。所述（b)中，所述"将野生菌和步骤（4) 筛选得到的菌株进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，然后用有 机溶剂抽提"的方法具体如下：将5〇 μ 1所述菌体破碎液、10〇μ 1含10mg/ml的人参皂苷 Rh的溶液（溶剂具体可为pH5. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为 200mM、柠檬酸浓度为lOOmM)混合，80°C静置20min，然后用正丁醇抽提并收集有机相。所 述（b)中，所述HPLC的参数如下：C18柱；洗脱液为乙腈或乙腈与水的混合液；洗脱过程：第 0-20min，乙腈在洗脱液中所占的体积百分数由30%线性上升至40% ;第20-35min，乙腈在洗 脱液中所占的体积百分数由40%线性上升至100% ;第35-40min，乙腈在洗脱液中所占的体 积百分数为100% ;第40-45min，乙腈在洗脱液中所占的体积百分数为30%。所述HPLC中的 流速具体可为1. 〇ml/min。人参阜苷compound K的峰值对应的保留时间为29. 766min。
[0022] 所述（a)和所述（b)可以为并列的关系，即仅进行其中之一；也可以为相互验证的 关系，即如果所述（a)和所述（b)中筛选得到同一菌株，该菌株可以进一步确认为具有将大 量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株。
[0023] 本发明还保护以上任一所述方法在筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有 人参皂苷的能力的蛋白质中的应用。所述应用的方法具体如下：采用以上任一所述方法筛 选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株，然后将筛选得到的菌株 提取质粒并对其中基因甲对应的区域进行测序，得到与所述基因甲对应的突变基因序列， 所述突变基因编码的蛋白质即为目的蛋白。
[0024] 为了高效快速地筛选转化稀有人参皂苷的生物催化剂，有必要建立高通量筛选平 台，提高筛选效率，以期快速、有效的获得新型转化系统。本发明提供的方法为由检测还原 糖入手的稀有人参皂苷生物转化体系的高通量筛选方法，辅之以薄层层析、高压液相色谱 定性定量检测产物生成量的操作方法。本发明不仅可应用本文实施案例中突变文库的筛 选，还可应用于其他催化合成稀有人参皂苷的生物催化系统的筛选，如环境微生物筛选、环 境基因组文库筛选、发酵条件优化筛选等。
[0025] 本发明还保护另一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能 力的菌株的方法，包括如下步骤：
[0026] ( 1)将野外采集的菌株进行培养并收集发酵产物；
[0027] (2)将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液；
[0028] (3)采用DNS法检测步骤（2)得到的反应液中的还原糖含量，测量0D54(lnm吸光值； 如果如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液的0D 54(tam吸光值大于空白对照的0D54tol吸光值， 该菌株即为本步骤筛选得到的菌株；
[0029] (4)进行（a)和 / 或（b);
[0030] (a)将步骤（3)筛选得到的菌株进行步骤（2)得到的反应液进行薄层层析；对于步 骤（3)筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（2)得到的反应液中具有稀有人参皂苷， 该菌株即为本步骤筛选得到的菌株；
[0031] (b)将步骤（3)筛选得到的菌株进行步骤（1)得到的发酵产物作用于所述大量存 在的人参皂苷，然后用有机溶剂抽提，然后进行HPLC;对于步骤（3)筛选得到的菌株来说， 如果某个菌进行步骤（1)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后得到了稀有人 参皂苷，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株。
[0032] 本发明还保护将序列表的序列1自N末端第218氨基酸残基由缬氨酸突变为甘氨 酸、第325位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质。
[0033] 编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下（1)或 (2)或（3)所述的DNA分子：
[0034] (1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0035] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码与所述蛋白质的DNA分子；
[0036] (3)与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0037] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0038] 含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护 范围。所述重组菌具体可为将所述基因通过表达质粒pET-28a(+)导入大肠杆菌BL2KDE3) 得到的重组菌。
[0039] 本发明还保护所述的重组菌的应用，为如下（I )或（II) :( I )制备所述蛋白质； (Π )以大量存在的人参皂苷为原料制备稀有人参皂苷。具体可利用所述重组菌的发酵产物 将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷。所述大量存在的人参皂苷具体可为人参皂苷 Rh。所述稀有人参皂苷具体可为人参皂苷compound K。所述发酵产物的制备方法如下： 将所述重组菌进行培养并收集发酵产物；所述"培养"的方法具体如下：在培养体系中加入 IPTG进行诱导。所述"培养"的方法具体如下：签挑取单菌落至800 μ 1含50 μ g/mL卡那 霉素的LB液体培养基，37°C、750rpm振荡培养24h，得到种子液；将5 μ 1所述种子液转接入 800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基，加入诱导剂IPTG至其浓度为0. ImM，然后 在30°C、750rpm振荡培养24h (此时约为2. 5)。所述"发酵产物"为整个发酵体系、 发酵上清或菌体破碎液。所述菌体破碎液菌体可为将所述发酵体系中的菌体进行破壁后得 到的上清液。所述菌体破碎液具体可按如下方法制备：取完成所述培养的整个的发酵体系， 尚心（尚心条件具体可为3000g、lOmin)并收集囷体，将囷体直于 _80 C放直30min后室温融 化，随后加入300 μ 1浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液(溶剂具体可为pH8. 0、50mM的Tris-HCl 缓冲液)，37°C、750rpm振荡反应lh，3000g离心lOmin并收集上清液，即为菌体破碎液。 [0040] 本发明还保护所述的蛋白质的应用，为如下(m)或αν)或（v):(m)作为β-糖苷 酶；（IV)制备β -糖苷酶；（V)以大量存在的人参皂苷为原料制备稀有人参皂苷。所述大 量存在的人参皂苷具体可为人参皂苷Rbi。所述稀有人参皂苷具体可为人参皂苷compound K〇
[0041] 本发明提供的蛋白质与现有野生型蛋白质相比，将大量存在的人参皂苷转化为稀 有人参皂苷的能力大大增加，本发明对于稀有人参皂苷的制备具有重大价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0042] 图1为实施例2中的薄层层析谱图。
[0043] 图2为实施例2中的HPLC谱图。

【具体实施方式】
[0044] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0045] 硫横矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus) DSM1616 : ATCC* 35091?。 pET-28a (+)载体购自Novagen公司，产品编号为69864-3。大肠杆菌BL21 (DE3 ):购自 默克公司（Merck),产品目录号为69450。人参皂甙Rbl，分子式为C54H920 23，CAS登录号 41753-43-9,购自北京百灵威化学技术有限公司，产品编号ASB-00007190-010。人参皂苷 compound K (简称CK)，分子式为C36H6108, CAS登录号39262-14-1，购自成都普瑞法科技开 发有限公司，产品编号G4038。溶菌酶：购自江晨生物，单位为20000U/mg。
[0046] S0C培养基：溶剂为水，含有如下溶质：2g/100mL蛋白胨、0. 5g/100mL酵母提取物、 10mM氯化钠、2. 5mM氯化钾、10mM氯化镁、10mM硫酸镁和20mM葡萄糖。
[0047] LB液体培养基：溶剂为水，含有如下溶质：胰蛋白胨10g/L、NaC110g/L和酵母提取 物 5g/L。
[0048] DNS溶液：溶剂为水，含有如下溶质：酒石酸钾钠182g/L、3, 5-二硝基水杨酸 6. 3g/L、氢氧化钠21g/L、亚硫酸钠5g/L和结晶酚5g/L。
[0049] 硫磺矿硫化叶菌的糖苷酶又称LacS蛋白，如序列表的序列1所示，其编码基 因又称lacS基因，如序列表的序列2所不。
[0050] 实施例1、通过构建含有现有蛋白的菌株的突变体库筛选具有将大量存在的人参 皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法。
[0051] 一、构建突变体文库
[0052] 1、提取硫磺矿硫化叶菌DSM1616的基因组DNA。
[0053] 2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回 收PCR扩增产物(约1470bp)。
[0054] F1 :5，-atggctagcatgtactcatttccaaatagc-3,；
[0055] R1 :5，-gtgctcgagttagtgccttaatggctttac-3,〇
[0056] PCR扩增的反应程序：95°C预变性 4min ;95°C 45s、55°C 30s、72°C lmin30s，30 个循 环；72°C 延伸 10min。
[0057] 3、用限制性内切酶Nhel和Xhol双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0058] 4、用限制性内切酶Nhel和Xhol双酶切pET_28a(+)载体，回收约5. 3kb的载体骨 架。
[0059] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a_lacS。根 据测序结果，对重组质粒pET28a_lacS进行结构描述如下：在pET_28a(+)载体的Nhel和 Xhol酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0060] 6、以重组质粒pET28a_lacS为模板，用F1和R1组成的引物对进行易错PCR，得到 含有多种突变形式的PCR扩增产物。
[0061] 易错 PCR 的反应体系：10 μ llOXrTaq DNA polymerase buffer (购自宝生物公 司）、9μ1 dNTP混合物（2.5mM，购自北京全式金公司，编号为AD101)、9yl dCTP(lOyM)、 9以1(11113(1(^]\〇(均购自宝生物公司）、5.5 4 10.1]\11%(：12水溶液、54 1?1(2.54]\〇、 5μ1 R1 (2· 5μΜ)、1·5μ15πιΜ MnCl^jC溶液、1 μ 1 rTaq DNA polymerase，补水至终体积 100 μ 1。
[0062] 易错 PCR 的反应程序：95°C预变性 4min ;95°C 45s、55°C 30s、72°C lmin30s，30 个 循环；72°C延伸10min。
[0063] 7、用限制性内切酶Nhel和Xhol双酶切步骤6得到的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0064] 8、用限制性内切酶Nhel和Xhol双酶切pET_28a(+)载体，回收约5. 3kb的载体骨 架。
[0065] 9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，然后将连接产物电击转化大肠 杆菌BL21 (DE3)的感受态细胞，然后在S0C培养基中37°C、250rpm振荡培养lh以进行复 苏，然后均匀涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，从平板上长出约2000个 单菌落，这些单菌落组成突变文库。
[0066] 10、将重组质粒pET28a_lacS代替步骤9的连接产物进行与步骤9相同的操作，随 机取5个单菌落，作为野生型对照菌。
[0067] 二、通过高通量筛选获得具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力 的突变体菌株
[0068] 将步骤一的9中的各个单菌落、5个野生型对照菌的单菌落分别进行如下步骤：
[0069] 1、用无菌牙签挑取单菌落至800μ 1含50μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基， 37°C、750rpm振荡培养24h，得到种子液。
[0070] 2、将约5 μ 1步骤1得到的种子液转接入800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体 培养基，加入诱导剂IPTG至其浓度为0. 1禮，然后在30°C、750rpm振荡培养24h(此时 约为2. 5)。
[0071] 3、取步骤2得到的培养体系，3000g离心lOmin并收集菌体，将菌体置于-80°C放 置30min后室温融化(本步骤的目的是细胞破壁)，随后加入300 μ 1浓度为10mg/ml的溶 菌酶溶液(溶剂为pH8. 0、50mM的Tris-HCl缓冲液)，37°C、750rpm振荡反应lh，3000g离心 lOmin并收集上清液，即为粗酶液。
[0072] 4、将100 μ 1步骤3得到的粗酶液和200 μ llmg/ml的人参皂苷叫溶液（溶剂为 pH5. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为200mM、柠檬酸浓度为lOOmM) 混勻，85°C静置30min后即刻置于冰上冷却。
[0073] 5、通过二硝基水杨酸法（DNS法）检测步骤4得到的反应液中的还原糖含量，具体 方法为：在步骤4得到的反应液中加入900 μ 1 DNS溶液，85°C水浴静置7min显色（生成较 多还原糖的突变体显棕红色)，测量〇D54(lnm吸光值。如果某反应液的0D 54(lnm吸光值大于5个 野生型对照菌步骤4得到的反应液的0D54tol吸光值的平均值，用于制备该反应液的单菌落 即为筛选得到的菌株。从突变体库中筛选得到5株菌(依次命名为菌株-1、菌株-2、菌株-3、 菌株-4和菌株-5)。
[0074] 6、将野生型对照菌进行上述步骤4得到的反应液以及步骤5筛选得到的5株菌进 行上述步骤4得到的反应液分别进行薄层层析（TLC)。
[0075] 展层剂如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (体积比）。
[0076] 目标物为人参皂苷compound K，其Rf值=0· 85。
[0077] 目测，如果某株菌步骤4得到的反应液中目标物的含量高于5个野生型对照菌中 的每个菌步骤4得到的反应液的目标物的含量，该菌株即为筛选得到的菌株。从步骤5得 到的5株菌中筛选得到3株菌(菌株-1、菌株-2和菌株-3)。
[0078] 7、采用高压液相色谱（HPLC)进行定量分析检测
[0079] 将野生型对照菌进行上述步骤3得到的粗酶液以及步骤5筛选得到的5株菌进行 上述步骤3得到的粗酶液进行如下步骤：
[0080] (1)将50μ1粗酶液、100yll0mg/ml的人参皂苷Rbl溶液（溶剂为PH5.5的磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为200mM、柠檬酸浓度为100mM)混合，80°C静 置 20min。
[0081] (2)取250μ 1完成步骤（1)的反应液，与250μ 1正丁醇混合，涡旋震荡30s， 12000g离心2min，吸取有机相。
[0082] (3)在步骤（2)的剩余物中再加入250 μ 1正丁醇，涡旋震荡30s，12000g离心 2min，吸取有机相。
[0083] (4)在步骤（3)的剩余物中再加入250 μ 1正丁醇，涡旋震荡30s，12000g离心 2min，吸取有机相。
[0084] (5)将步骤（2)得到的有机相、步骤（3)得到的有机相和步骤（4)得到的有机相混 合，旋转蒸干后用400 μ 1甲醇重溶。
[0085] (6 )将步骤（5 )得到的溶液进行HPLC。
[0086] HPLC 参数：C18 柱（Waters Symmetry, 250mm X 4. 6mm, 5 μ m);
[0087] 柱温为 35°C ;
[0088] 洗脱液为乙腈或乙腈与水的混合液；
[0089] 洗脱过程：第0_20min，乙腈在洗脱液中所占的体积百分数由30%线性上升至40% ; 第20-35min，乙腈在洗脱液中所占的体积百分数由40%线性上升至100% ;第35-40min，乙 腈在洗脱液中所占的体积百分数为100% ;第40-45min，乙腈在洗脱液中所占的体积百分数 为 30% ;
[0090] 流速为 1. Oml/min ;
[0091] 检测波长为203nm。
[0092] 人参皂苷compound K标准品的峰值对应的保留时间29. 766min。根据人参皂苷 compound K标准品的峰面积与浓度绘制标准曲线并制作标准曲线方程：人参阜苷compound K标准品浓度（mg/ml) =0. 00006. 75 X峰面积。
[0093] 对照标准曲线方程，5株野生型对照菌的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶 液中的人参阜苷compound K的平均浓度为0· 62mg/ml。
[0094] 对照标准曲线，菌株-1的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中的人参皂 苷 compound K 的浓度为 1. 62mg/ml。
[0095] 对照标准曲线，菌株-2的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中的人参皂 苷 compound K 的浓度为 1. 22mg/ml。
[0096] 对照标准曲线，菌株-3的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中的人参皂 苷 compound K 的浓度为 0· 93mg/ml。
[0097] 对照标准曲线，菌株-4的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中的人参皂 苷 compound K 的浓度为 0· 88mg/ml。
[0098] 对照标准曲线，菌株-5的粗酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中的人参皂 苷 compound K 的浓度为 0· 91mg/ml。
[0099] 菌株-1得到的粗酶液将人参皂苷Rbl转化为人参皂苷compound K的活性最高。
[0100] 8、将菌株-1提取质粒，以提取得到的质粒为模板，用F1和R1组成的引物对进行 PCR扩增，回收PCR扩增产物并进行测序，该PCR扩增产物与序列表的序列2的差异仅在于 将序列2自5'末端第653核苷酸由T突变为了 G、第973位核苷酸由A突变为了 G，相应的 编码将序列表的序列1自N末端第218氨基酸残基由缬氨酸突变为甘氨酸、第325位氨基 酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质(将其命名为La CSV218e/T325A蛋白）。
[0101] 实施例2、通过构建现有蛋白编码基因的突变体库筛选具有将大量存在的人参皂 苷转化为稀有人参皂苷的能力的突变蛋白的方法。
[0102] 1、取实施例1的步骤二的5得到的5株菌和5株野生型对照菌在实施例1的步骤 二的3得到的粗酶液，进行亲和层析。
[0103] 亲和层析采用镍离子亲和层析柱（Novagen公司生产，产品编号为70666-3,柱体 积为lml)。具体洗脱过程，先用3ml漂洗缓冲液(含20mM咪唑、300mM NaCl的pH8、50mM Tris-HCl缓冲液）洗涤以去除杂蛋白，然后用2ml洗脱缓冲液(含250mM咪唑、300mM NaCl 的pH8、50mM Tris-HCl缓冲液）洗涤并收集过柱后溶液，透析(透析液为pH5. 5的MC缓冲 液，由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为lOOmM柠檬酸和水组成；透析袋的截留分子量 为8000-14000)后得到纯化酶液。
[0104] 用缓冲液（pH5. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为200mM、 柠檬酸浓度为l〇〇mM)调整每种纯化酶液的蛋白浓度均为0. 78mg/ml，即为调整后纯化酶 液。
[0105] 2、将步骤1得到的调整后纯化酶液取代粗酶液，其它同实施例1的步骤二的4。
[0106] 3、将5株野生型对照菌进行上述步骤1和2后得到的反应液以及实施例1的步骤 二的5得到的5株菌进行上述步骤1和2后得到的反应液分别进行薄层层析（TLC)。
[0107] 展层剂如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (体积比）。
[0108] 目标物为人参皂苷compound K，其Rf值=0· 85。
[0109]目测，如果某株菌进行上述步骤得到的反应液中目标物的含量高于5个野生型对 照菌中的每个菌进行上述步骤得到的反应液的目标物的含量，该菌株即为筛选得到的菌 株。从步骤5得到的5株菌中筛选得到3株菌(菌株-1、菌株-2和菌株-3)。菌株-1进行 上述步骤得到的反应液的薄层层析图谱见图1 (WT代表1株野生菌，Mutant代表菌株-1)。
[0110] 4、采用高压液相色谱（HPLC)进行定量的分析检测
[0111] 用步骤1得到的调整后纯化酶液取代粗酶液，其它同实施例1的步骤二的7。
[0112] 对照标准曲线方程，5株野生型对照菌的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5) 得到的溶液中的人参阜苷compound K的平均浓度为1. lmg/ml。
[0113] 对照标准曲线，菌株-1的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液的 HPLC图谱见图2 (横坐标13. 496min对应的峰为人参皂苷Rd，横坐标26. 042min对应的峰 为溶剂峰，横坐标29. 766min对应的峰为人参阜苷compound K)，其中的人参阜苷compound K的浓度为3. 5mg/ml。
[0114] 对照标准曲线，菌株-2的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中 的人参阜苷compound K的浓度为3. 2mg/ml。
[0115] 对照标准曲线，菌株-3的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中 的人参阜苷compound K的浓度为1. 4mg/ml。
[0116] 对照标准曲线，菌株-4的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中 的人参阜苷compound K的浓度为1. 5mg/ml。
[0117] 对照标准曲线，菌株-5的调整后纯化酶液进行上述实验，步骤（5)得到的溶液中 的人参阜苷compound K的浓度为1. 4mg/ml。
[0118] 即菌株-1所表达的LaCSV218G/T325A蛋白将人参皂苷Rbl转化为人参皂苷compound K的活性最尚。
【权利要求】
1. 一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法，包 括如下步骤： (1) 将基因甲插入表达质粒的多克隆位点后转化宿主菌，得到野生菌；将基因甲或含有 所述基因甲的质粒作为模板并将所述基因甲作为靶区域进行易错PCR，将所述易错PCR的 产物插入所述表达质粒的多克隆位点后转化所述宿主菌，得到的所有单菌落组成突变菌株 库；所述基因甲为已知的具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的蛋白质 的编码基因； (2) 将野生菌和突变菌株库中的每个菌分别进行培养并收集发酵产物； (3) 将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液； (4) 采用DNS法检测步骤（3)得到的反应液中的还原糖含量，测量0D54(tam吸光值；对于 突变菌株库中的每个菌来说，如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液的0D 54(tam吸光值大于 野生菌进行步骤（3)得到的反应液的0D54(tam吸光值，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株； (5) 进行（a)和/或（b); (a) 将野生菌和步骤（4)筛选得到的菌株进行步骤（3)得到的反应液进行薄层层析；对 于步骤（4)筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液中稀有人参皂苷 的含量高于野生菌进行步骤（3)得到的反应液中稀有人参皂苷的含量，该菌株即为本步骤 筛选得到的菌株； (b) 将野生菌和步骤（4)筛选得到的菌株进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大 量存在的人参皂苷，然后用有机溶剂抽提，然后进行HPLC ;对于步骤（4)筛选得到的菌株来 说，如果某个菌进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后稀有人参 皂苷的产量高于野生菌进行步骤（2)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后稀 有人参皂苷的产量，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大量存在的人参皂苷为人参皂苷Rbp 所述稀有人参皂苷为人参皂苷compound K。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因甲为编码β-糖苷酶的基因。
4. 权利要求1至3中任一所述方法在筛选具有将大量存在的人参阜苷转化为稀有人参 皂苷的能力的蛋白质中的应用。
5. -种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法，包 括如下步骤： (1) 将野外采集的菌株进行培养并收集发酵产物； (2) 将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液； (3) 采用DNS法检测步骤（2)得到的反应液中的还原糖含量，测量0D54(tam吸光值；如果 如果某个菌进行步骤（3)得到的反应液的0D 54tol吸光值大于空白对照的0D54(tam吸光值，该 菌株即为本步骤筛选得到的菌株； (4) 进行（a)和/或（b); (a) 将步骤（3)筛选得到的菌株进行步骤（2)得到的反应液进行薄层层析；对于步骤 (3)筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（2)得到的反应液中具有稀有人参皂苷，该 菌株即为本步骤筛选得到的菌株； (b) 将步骤（3)筛选得到的菌株进行步骤（1)得到的发酵产物作用于所述大量存在的 人参皂苷，然后用有机溶剂抽提，然后进行HPLC ;对于步骤（3)筛选得到的菌株来说，如果 某个菌进行步骤（1)得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后得到了稀有人参皂 苷，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株。
6. 将序列表的序列1自N末端第218氨基酸残基由缬氨酸突变为甘氨酸、第325位氨 基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质。
7. 编码权利要求6所述蛋白的基因。
8. 含有权利要求7所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
9. 权利要求8所述的重组菌的应用，为如下（I )或（II) : ( I )制备权利要求6所述蛋 白质；（II)以大量存在的人参皂苷为原料制备稀有人参皂苷。
10. 权利要求6所述的蛋白质的应用，为如下(III)或(IV)或（ν):(ΙΙΙ)作为β-糖苷 酶；（IV)制备β -糖苷酶；（V)以大量存在的人参皂苷为原料制备稀有人参皂苷。
【文档编号】C12N9/42GK104232671SQ201310246807
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2013年6月20日
【发明者】梁朝宁, 熊丹丹, 唐双焱 申请人:中国科学院微生物研究所