miR-7及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种miR-7及其应用。本发明通过三维胶原海绵支架培养细胞体系发现miR-7通过调控Klf4基因进而促进神经干细胞分化，从而筛选到miR-7。在神经干细胞内过表达或敲低miR-7，进一步证实miR-7具有促进神经干细胞定向分化为神经元的功能。
【专利说明】miR-7及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种miRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] 当今颅脑和脊髓外伤、脑血管疾病、神经系统先天性疾病和罹患神经退变性疾病 人数急剧上升，人类一旦发生脑出血、脑梗塞、脑外伤、脊髓损伤等疾病后，损伤的神经功能 难以自我修复，多遗留严重的后遗症。神经干细胞作为一种具备自我更新能力及多向分化 潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突 胶质细胞和星形细胞。神经干细胞为神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径， 具有广泛的临床应用前景。寻找促进神经干细胞分化的因素对于组织再生、神经系统退行 性疾病、脑外伤以及脑肿瘤的发生、发展和治疗有着非常重要的意义，许多研究发现小分子 化合物AICAR、生长因子FGF，生物材料石墨烯等具有促进神经元分化的作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种miRNA及其应用，所述miRNA命名为miR-7。
[0004] 本发明提供的miRNA具有下述核苷酸序列之一：
[0005] 1)序列表中SEQID Ns . 1所示的核苷酸序列；
[0006] 2)与1)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且参与神经干细胞的分化或神 经干细胞的自我更新的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以 上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0007] 所述参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA是通过 调控其下游基因Klf4的表达来参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新。
[0008] 所述参与神经干细胞的分化，具体指所述miRNA促进所述神经干细胞的分化。
[0009] 所述参与神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA抑制所述神经干细胞的自我 更新。
[0010] 所述神经干细胞具体为大鼠神经干细胞。
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述miRNA在制备具有下述任意一种功能的产品中 的应用：
[0012] 1)调节神经干细胞的分化；
[0013] 2)调节神经干细胞的自我更新；
[0014] 3)调节神经干细胞的全能性。
[0015] 所述调节神经干细胞的分化为促进神经干细胞的分化；
[0016] 所述调节神经干细胞的自我更新为抑制神经干细胞的自我更新；
[0017] 所述调节神经干细胞的全能性为抑制神经干细胞的全能性。
[0018] 所述应用中，所述促进神经干细胞分化具体指促进神经干细胞分化为神经元。
[0019] 本发明的另一个目的是提供所述的miRNA在制备具有调控Klf4、Nestin、 Vimentin、Map2和/或Tujl基因表达功能产品中的应用。
[0020] 具体的，所述调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tujl基因表达指抑制 Klf4、Nestin和/或Vimentin基因的表达；和/或促进Map2和/或Tujl基因的表达。[0021] 本发明的再一个目的是提供一种筛选所述miRNA的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0022] 1)将全能干细胞分别在二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养；
[0023] 2)分析miRNA在步骤1)所述的两个培养体系中培养的全能干细胞中的表达差异；
[0024] 3)选取表达差异达到统计学显著水平的miRNA进行分离、测序即得。
[0025] 所述步骤1)中，所述三维胶原海绵培养体系具体指以胶原海绵为三维支架的培养 体系。
[0026] 所述胶原海绵购自美国美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc)。
[0027] 所述方法中，所述全能干细胞具体为PA-1细胞或神经干细胞。
[0028] 所述方法中，所述二维培养体系具体指常规的单层细胞平面培养体系。
[0029] 本发明通过三维胶原海绵支架培养细胞体系筛选到miR-7,miR-7通过调控Klf4 基因进而促进神经干细胞分化，进而通过在神经干细胞内过表达或敲低miR-7,检测miR-7 表达情况对神经干细胞分化的影响，进一步证实miR-7具有促进神经干细胞定向分化为神 经元的功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为三维培养体系中表达下调的miRNA与PA-1细胞自我更新调控关键基因的 调控网络图。
[0031] 图2为Real-timePCR方法检测miR-7在三维培养体系（3D)或二维培养体系（2D) 培养的PA-1细胞内的表达情况，其中**表示P〈0. 01。
[0032] 图3为Real-timePCR方法检测三维培养体系（3D)或二维培养体系（2D)内大鼠 神经干细胞自我更新及分化相关基因的表达情况，其中**表示P〈〇. 01。
[0033] 图4为Real-timePCR方法检测三维培养体系（3-D)和二维培养体系（2-D)内大 鼠神经干细胞中miR-7 (图4A)和Klf4基因（图4B)的表达情况。
[0034] 图5为Real-timePCR方法检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞 自我更新相关基因Nestin、Sox2、Vimentin和分化相关基因Tujl、Map2的表达情况，其中* 表示P〈0. 05, ** 表示P〈0. 01。
[0035] 图6为免疫荧光检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞自我更新相 关基因Nestin(图6A)，Sox2 (图6B)，Vimentin(图6C)和分化相关基因Tujl(图6D)， Map2 (图6E)，的表达情况，其中*表示P〈0. 05，#表示P〈0. 01。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中如无特殊说明，所述液体与液体的比值为体积与体积比或体积百分 含量；所述液体与固体的比值为体积与质量比；所述固体与固体的比值为质量与质量比或 质量百分含量。
[0039] 胶原海绵购自美国美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc)
[0040] 实施例1、以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞
[0041](一）细胞的二维培养
[0042]PA-1细胞的二维培养：
[0043] PA-1细胞购自中国协和医科大学基础医学院，为ATCC细胞库收录（ATCC? CRL-1572?)。于37°C、5%C02、饱和湿度的C02培养箱中无菌培养（ThermoForma公司）。培 养基为高糖DMEM(Hyclone)，含体积百分比为10%的胎牛血清（Gibco)、青霉素100U/ml、链 霉素0.lmg/ml，在37°C、5%C02培养箱中培养，隔日传代。细胞传代时用0. 25%的胰蛋白酶 进行消化。
[0044] 大鼠神经干细胞的分离与二维培养：
[0045] 取8只SD乳鼠（出生12小时以内的乳鼠)(购自北京维通利华实验动物技术有限公 司），在75%酒精中浸泡处死，在超净台内断头，取出端脑，将端脑转移至预冷的含糖PBS(内 含0. 1M葡萄糖)中，仔细地剔除血管和脑膜，在预冷的含糖PBS中洗3次，将PBS吸干，弯剪 剪碎脑组织，将组织转移至15ml离心管，加0. 25%胰酶，37°C消化40分钟，消化20分钟时 拿出来吹打一次，消化40分钟后用胰酶抑制剂终止消化，加基础培养基，吹散沉淀，注意尽 量不要产生气泡，2〇〇目细胞筛过滤后，500g离心5分钟，去掉上清，加入添加有B27、20ng/ mlbFGF和20ng/mlEGF的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02、 饱和湿度的培养箱中悬浮培养，培养3天后换液，继续培养至7天，形成直径100-200ym的 神经球。将含神经球的悬浮培养基倒入离心管中，250g离心5分钟，去掉上清，收集沉淀。 加入0. 25%胰酶消化，室温孵育15-20分钟，在第8分钟时，轻轻将沉底的细胞团块吹散，继 续孵育，孵育至20分钟后，用含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶作 用，显微镜下计数细胞，细胞计数后按照1X105细胞/cm2密度将细胞接种在用多聚赖氨酸 处理(用lmg/ml多聚赖氨酸溶液将培养皿底部铺满，37°C孵育2小时后，洗掉多聚赖氨酸， 在超净台中吹干，用PBS洗2遍）的细胞培养板或培养皿中。神经干细胞贴壁培养24小时 后，用PBS洗两次，换为含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基。
[0046](二）以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞
[0047] 以胶原海绵为支架的PA-1细胞的三维培养：
[0048] 将二维培养的PA-1细胞用0. 25%的胰酶消化，显微镜下计数细胞，在每块胶原海 绵上接种20yl的5X106/mL细胞，在37°C、5%C02培养箱中贴壁培养4小时后，将内含胶原 海绵材料的l〇cm的细胞皿内补充10ml内含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养 基，继续培养7天，隔日换液。
[0049] 以胶原海绵为支架的大鼠神经干细胞的三维培养：
[0050] 1、神经干细胞悬浮培养(悬浮培养为三维成球培养方法）：
[0051] 神经干细胞扩增培养基（100ml):
[0052]非必需氨基酸 100X1ml;丙酮酸钠 100X1ml;双抗 100X1ml;B2750X2ml; 30%Glu2ml;EGF(0?lmg/ml) 20ii1;bFGF(0?lmg/ml) 20ii1 ;肝素（0? 05g/2ml) 7. 32ii1 ; DMEM/F12(1:1)92. 07ml；
[0053] 培养条件：在37°C、5%C02培养箱中培养7天扩增形成的神经球，用0. 25%的胰酶 消化，室温孵育15-20分钟，在第8分钟时，轻轻将沉底的细胞团块吹散，继续孵育，孵育至 20分钟后，用含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶作用。
[0054] 2、以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞：
[0055] 显微镜下计数上述悬浮培养的细胞，每块胶原海绵上接种20yl的5X107/mL细 胞，在37°C、5%C02培养箱中贴壁培养4小时后，将内含胶原海绵材料的10cm的细胞皿内补 充10ml内含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养1天，第二日，将细 胞培养基更换为内含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基中，培 养7天，隔代换液。
[0056] 实施例2、microRNA表达谱基因芯片检测、miRNA-靶基因调控网络构建及miR-7 的制备
[0057] (一）miRNA提取
[0058]利用mirVanaTMmiRNAIsolationmiRNA提取试剂盒（Cat#1560，Ambion)分别 提取由实施例1得到的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中培养的PA-1细胞的总 miRNA。根据试剂盒的说明提取和富集样品的miRNA，具体操作步骤如下：
[0059] (1)收获IX106 细胞，加入 1:10 (w/v)的Lysis/BindingBuffer，旋润振荡混勻。
[0060] (2)加入1/10体积的miRNAHomogenateAdditive。旋润振荡混勻或上下颠倒数 次，冰浴10分钟。
[0061] (3)加入一倍体积的Acid-Phenol:Chloroform(体积是在没有加入miRNA HomogenateAdditive前的体积)，旋润振荡30-60秒，以最大速度（10,000Xg)室温离心5 分钟，以确保液相分层，如分层不明显，再次离心。
[0062] (4)将滤过液的上清液(水相）转移到新的离心管中，注意转移液体的体积。
[0063] (5 )加入1 /3体积的100 %乙醇，混匀。
[0064] (6)将细胞裂解液和乙醇混合液转移到FilterCartridge，10,000Xg(10， OOOrpm)离心15秒，保留滤过液，滤过管可参照下述步骤（10)- (16)提取滤过管中残留的 总RNA。
[0065] (7)滤过液中加入2/3体积的无水乙醇，混匀。
[0066] (8)将细胞裂解液和乙醇混合液转移到FilterCartridge，10,000Xg(10， OOOrpm)离心15秒，弃滤过液，保留滤过管。
[0067] (9)如果体积大于700ii1，继续将液体转移到FilterCartridge后离心。
[0068] (10)加入 700u1miRNAWashSolutionl到FilterCartridge中，离心 5 - 10 秒，弃滤过液，保留收集管。
[0069] (11)加入 500u1WashSolution2/3 到FilterCartridge中，离心 5 - 10 秒，弃 滤过液，保留收集管。
[0070] (12)再加入 500u1WashSolution2/3 到FilterCartridge中，离心 5 - 10 秒洗 柱。
[0071] (13)为除尽FilterCartridge中液体，更换收集管(用户自备）后以最大转速离 心1分钟。
[0072](14)将洗脱液或无核酸酶水预热到95°C，洗脱液是无核酸酶的0.ImMEDTA(如果 影响实验分析，可选用无核酸酶水替代)。
[0073] (15)将FilterCartridge转移到提供的收集管中，直接将100ill预热好的洗脱 液或是无核酸酶水加到胶床上，以最大转速离心20-30秒洗脱RNA。
[0074] (16)为获得更高产量的RNA，重复步骤（16)-次，将离心洗脱液收集到同一收集 管中。
[0075] (17)用1%变性的琼脂糖凝胶电泳检测所得到的总RNA，并用紫外分光光度计检测 RNA的浓度和纯度。
[0076] (18)剩余的含miRNA的洗脱液保存在_20°C。
[0077](二）microRNA表达谱基因芯片检测
[0078] (1)芯片及探针的制备
[0079] 米用美国LC Sciences公司提供的(iParaflo? microRNA微阵列芯片，对Sanger miRBase数据库最新报道的人的microRNA进行检测，从而确保了对microRNA进行直接检测 的高灵敏性和高特异性。
[0080] 芯片探针序列信息来自于SangermiRBaseReleasel9. 0版本数据库（http:// microrna.sanger.ac.uk/sequences)〇
[0081] 每个检测探针是由PGR(光敏试剂）化学试剂原位合成，包含了一段编码区域和一 个延伸臂片段。编码区域是一个经化学修饰的核苷酸编码片段，这些片段与靶miRNA或其 它靶RNA互补，可以提高检测的灵敏度和特异性，同时还能提高杂交亲和活性从而平衡探 针的Tm值。延伸臂片段能使与它连接的编码片段片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍。 每个探针在同张芯片里重复5个点，进一步提高了芯片的可靠性。
[0082] (2)芯片的杂交、显色、洗涤和扫描
[0083] 分别将上述提取得到的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系培养得到的PA-1 细胞的总miRNA，通过YM-lOO(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。 Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA3 '端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，使 用Cy3和Cy5特异性荧光标记进行双样品杂交试验。用Cy3和Cy5特异性荧光分别标记二 维培养PA-1细胞和三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞，
[0084] 将两个标记好的样品杂交到一张制备好的microRNA微阵列芯片上。杂交反应通 过微循环泵杂交仪器在IParaflo?'微流体芯片上过夜(AtacticTechnologies)。杂交使用 含有体积百分比为25%的甲酰胺的100iiL6xSSPE缓冲液（0. 90MNaCl、60mMNa2HP04、6mM EDTA、pH6. 8,溶剂为水），杂交温度34°C。
[0085] 杂交后的芯片采用激光扫描仪（GenePix4000B，MolecularDevice)采集杂交图 象；将采集的杂交图像再经Array-Pro(MediaCybernetics)软件进行处理分析，把图像信 号转化为数字信号，得扫描图谱；检测样品在扫描图谱中会出现红色，绿色或黄色的杂交 点，其中，红色表不基因表达上调；绿色表不表不基因表达下调，黄色表不两个样本间的基 因表达量基本相当。
[0086] (3)芯片扫描结果的分析
[0087] 将上述获得的扫描图谱保存为标签图像文件格式（Tagged Image File Format, TIFF),通过Axon GenePix4000B Microarray Scanner将图像的像素质转化为数字信号，并 导出成分析软件可识别得文件格式（.dat和.cel文件)。在进行芯片的比较分析前，对每一 张芯片进行扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过L0WESS (Locally-Weighted Regression)过滤进行标准化。对于双色标记实验，计算三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞和二维培养PA-1细胞两组样本检测信号的比值（log2)和t-test的p值。以p 值〈0. 01定义显著差异性表达。
[0088] 芯片扫描分析结果显示，共鉴定出326个在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细 胞中的miRNA的表达与在二维培养体系培养的PA-1细胞中的miRNA的表达有显著性差异。
[0089] (4)miRNA-靶基因网络的构建
[0090] 使用TargetScan(release6. 2)对上述鉴定出的326个miRNA的革巴基 因进行预测。对其中30个在三维胶原海绵培养体系中下调表达的miRNA，使用 Cytoscape(version3. 0. 1)网络构建工具构建了这些miRNA对其靶基因即多能性因子 0ct4，Sox2，Klf4和Nanog的调控网络，结果见图1。图1显示，在网络图中，节点的大小与 节点的入度相关；边的样式与靶位点的保守性相关，从实体线到短划线再到虚线表示保守 性依次降低；边的粗细从细到粗对应于miRNA在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞中 的表达与在二维培养体系培养的PA-1细胞中的表达的差异倍数由小到大；其中，miR-7调 控的靶基因之一为Klf4,且miR-7在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞中的表达与在 二维培养体系培养的PA-1细胞中的表达的差异倍数较大。构建的miRNA-靶基因网络结果 部分解释了三维胶原海绵培养体系相较于二维培养体系，能更好的维持干细胞自我更新机 制的分子机理。
[0091] (5)miR-7的制备及Real-timeRT-PCR验证芯片检测结果
[0092] 抽取miRNA芯片中筛选的差异表达的miRNA-7进行Real-timePCR，验证芯片结 果。
[0093] 分别提取由实施例1培养得到二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中的PA-1 细胞的总miRNA，miNA提取方法同本实施例(一)所述。使用invitrogenmiRNA反转录试剂 盒（TaqmanmicroRNAreversetranscriptionkitcatN0. 4366596)将制备得到的miRNA 分别逆转录为相应的cDNA。反转录反应体系如表1所示。
[0094]表1
[0095]
【权利要求】
1. 一种miRNA，所述miRNA具有下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns . 1所示的核苷酸序列； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且参与神经干细胞的分化或神经干 细胞的自我更新的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再 具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2. 权利要求1所述的miRNA在制备具有下述任意一种功能的产品中的应用： 1) 调节神经干细胞的分化； 2) 调节神经干细胞的自我更新； 3) 调节神经干细胞的全能性。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于： 所述调节神经干细胞的分化为促进神经干细胞的分化； 所述调节神经干细胞的自我更新为抑制神经干细胞的自我更新； 所述调节神经干细胞的全能性为抑制神经干细胞的全能性。
4. 权利要求1所述的miRNA在制备具有调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tujl 基因表达功能产品中的应用。
5. -种筛选权利要求1所述miRNA的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 将全能干细胞分别在二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养； 2) 分析miRNA在步骤1)所述的两个培养体系中培养的全能干细胞中的表达差异； 3) 选取表达差异达到统计学显著水平的miRNA进行分离、测序即得。
【文档编号】C12Q1/68GK104342439SQ201310311571
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月23日 优先权日:2013年7月23日
【发明者】崔熠, 肖志峰, 魏建树, 陈冰, 陈同, 戴建武 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所