一种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途
【专利摘要】本发明提供了一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，重组位点是目的基因的最后一个外显子的终止密码子后，把IRES-报告基因重组在目的基因的最后一个外显子的终止密码子后。重组后，目的基因和报告基因一起转录成融合的mRNA，目的基因mRNA各外显子剪接正确，并分别翻译成报告基因蛋白和目的基因蛋白，报告基因蛋白可以定时检测，通过报告基因的表达变化反映目的基因表达调控。该重组方法为目的基因的表达调控研究提供完全天然染色体环境。
【专利说明】—种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种报告基因插入染色体完整目的基因位点、构建方法和用途。
【背景技术】
[0002]基因打祀技术(gene targeting)是一项新兴的分子生物学技术,是利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，将外源DNA定点整合入受体细胞基因组上某一确定的位点。基因打靶技术在研究基因的结构和功能、表达与调控、转基因及基因治疗等方面已经成为有力的工具。
[0003]利用报告基因可有效地研究目的基因的表达调控。目前多数转基因动物报告基因的表达是由目的基因启动子驱动，可以研究目的基因启动子的调控。由于基因增强子、位点控制区域(locus control region, LCR)及绝缘子(insulators)等调控元件对于基因的表达和调控十分重要，但这些元件常常距基因有约50 kb之遥，而且目的基因所包含的天然内含子可能带有影响mRNA剪接和调控蛋白表达的信号，目的基因所处的天然的染色体环境也是调控基因表达的重要因素。但目前，报告基因重组在“天然”染色体目的基因上的研究报道较少。因此，迫切需要建立报告基因重组在染色体目的基因上的报告基因转基因动物，为目的基因的表达调控研究提供基本完全天然的染色体环境。因此，本发明确定了报告基因重组在染色体目的基因上的位点 ，利用基因打靶技术构建报告基因重组在目的基因上的报告基因转基因动物，为在完全天然染色体背景下研究完整目的基因表达和调控建立了研
口 o
【发明内容】
[0004]本发明公开一种报告基因重组在染色体完整目的基因上的方法。
[0005]也就是说，本发明目的是提供一种建立报告基因重组在染色体完整目的基因上的方法，确定报告基因插入目的基因的位点，利用基因打靶技术构建报告基因重组在目的基因上的报告基因转基因动物，该位点报告基因的插入，为目的基因表达和调控研究提供了完全天然染色体环境。
[0006]一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于重组位点是目的基因的最后一个外显子的终止密码子后，把IRES-报告基因重组在目的基因的最后一个外显子的终止密码子后。
[0007]重组后，目的基因和IRES-报告基因一起转录成融合的mRNA，目的基因mRNA各外显子剪接正确。
[0008]IRES-报告基因与目的基因融合的mRNA，分别翻译成报告基因蛋白和目的基因蛋白。报告基因蛋白可以定时检测。由于报告基因与目的基因一起转录成融合的mRNA，报告基因的表达能相对定量目的基因的表达。[0009]重组方法中的IRES，报告基因可以从市售报告基因质粒获得。其中市售报告基因质粒可以是荧光素酶系列报告基因质粒，荧光蛋白系列报告基因质粒，分泌性碱性磷酸酶系列报告基因质粒。
[0010]在建立转基因动物前，需要先进行体外实验，确定报告基因重组在染色体完整目的基因上的位点，考察此位点的重组，是否会引起目的基因mRNA剪接错误，影响目的基因mRNA完整性，以及报告基因能否反映目的基因表达调控。
[0011]然而，目前由于完整目的基因为大片段DNAOlO kb)，在技术上，研究比较困难，长期限制了报告基因在完整目的基因的表达调控研究上的应用。细菌人工染色体(BacterialArtificial Chromosome, BAC)为目的基因研究提供了基本完整的染色体DNA背景。BAC同源重组，为报告基因与完整目的基因重组提供了简便、可行的实验工具。
[0012]本发明通过BAC同源重组，选择报告基因插入目的基因的位点，考察此位点的重组，是否会引起目的基因mRNA剪接错误，影响目的基因mRNA完整性，以及报告基因能否反映目的基因表达调控。体外实验确定报告基因插入目的基因的位点后，构建报告基因重组在染色体原位目的基因上的报告基因转基因动物，在整体水平，为在完全天然染色体背景下研究目的基因表达和调控提供了研究平台。
[0013]体外BAC同源重组基因工程方法基于3个X Red-encoded基因(Red,recombination deficient mutant of phage 卩遼菌体重组缺陷型)exo, bet 和 gam 介导的同源重组。Exo编码5’-3’核酸外切酶产生待插入双链DNA3’悬端，bet编码一对蛋白，该蛋白绑定在待插入双链DNA3’悬端，并介导退火以及与BAC上互补DNA发生同源重组。Gam编码RecB⑶核酸外切酶抑制蛋白，保护待重组的DNA不被RecB⑶降解。Exo，bet和gam的表达由温度敏感的抑制物控制，细菌在32°C培养时，这三个基因不表达。细菌42°C，15分钟，exo, bet和gam被快速诱导至高表达水平，同源重组得以有效进行。
[0014]体外BAC同源重组基因工程方法选择系统为galK阳性选择和阴性选择。E.coli半乳糖操纵子由四个结构基因 组成，四个结构基因依次排列:galE(编码半乳糖差向异构酶)、galT(编码半乳糖转移酶)和galK(编码半乳糖激酶)和galM。当半乳糖作为唯一碳源时，这些基因是细菌生长必须的。galK编码的半乳糖激酶催化半乳糖降解第一步，磷酸化半乳糖。半乳糖激酶也可以有效催化2-脱氧-半乳糖(DOG) —一半乳糖类似物的磷酸化。磷酸化的DOG不能被代谢，导致毒性蓄积。这样就形成了以galK为基础的阳性选择和阴性选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1 BAC重组和galK阳性选择和阴性选择流程示意图。
[0016]图2 分段 PCR 初步证实 3’ mDAT-1RES-G-luc 插入得到 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc重组子菌落。其中
泳道 1:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 1-F 和 2-R ;
泳道 2:templte: pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc, primer: 1_F 和 2-R ；
泳道 3:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 2_F 和 2-R ；
泳道 4:templte: pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc，primer: 2_F 和 2-R ;
泳道 5:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 3_F 和 3-R ；泳道 6:templte: pBACe3.6-AC154547-3> mDAT-1RES-G-luc, primer: 3_F 和 3-R。
[0017]图3 SmaI 酶切，证实 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 重组子正确。左图为0.25v/cm, 12 h ;右图为20 h。其中
泳道 A:pBACe3.6-AC154547 SmaI digestion ；
泳道 B:pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc SmaI digestion。
[0018]图4 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G_luc 转染 HEK293 细胞，测定培养液和细胞G-1uc表达。其中
VAP:丙戊酸(终浓度5 PM)；
BAC-9k:指 pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc ；
BAC-Pac:指 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 经 PacI 酶切，自连后，仍然包含mDAT全基因。
[0019]图5 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc 转染 HEK293 细胞，逆转录 PCR 证实G-1uc与DAT 一起转录成融合的mRNA。其中，泳道I~5:引物:mouse-DAT RT-F 881和mouse-DAT RT-R 1149 扩增子为 mDATc 881bp_1149 bp,长度 269 bp ;泳道 6~10:引物:RT-BAC-1uc-1-F 1710 和 RT-BAC-luc-1-R 扩增子长度 893 bp。
泳道I HEK293 (无转染)丙戊酸+，
泳道 2 HEK 293T 转染 pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc，
泳道 3 HEK 293T 转染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，丙戊酸+，
泳道 4 HEK 293T 转染 BAC-Pac，
泳道5 HEK 293T转染BAC-Pac，丙戊酸+，
泳道6 HEK 293丙戊酸+，
泳道 7 HEK 293 转染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，
泳道 8 HEK 293 转染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，丙戊酸+，
泳道 9 HEK 293 转染 BAC-Pac，
泳道10 HEK 293转染BAC-Pac，丙戊酸+，
其中 BAC-Pac:pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 经 PacI 酶切，自连后，仍然包含mDAT全基因。
图6原位mDAT-1RES-G-luc报告基因转基因小鼠构建流程示意图。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。
[0021]本发明实施例中所使用的限制性内切酶为商业产品。质粒载体、菌株均为商业产品，本实验室保存。
[0022]实施例1构建PgalK质粒
1、通过两步PCR,克隆galK开放阅读框ORF至pBluescript SK(-)的EcoRI和BamHI位点。引物:
galK ORF I F:
5，-CCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGT-3，；galK ORF 2 F: AAATMGAATTCCTGTTGACMTTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCAGGAGGCAGATCATG ； (EcoRI site 下划线)
galK ORF R: AATAAAGGATCCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT-3J (BamHI 位点下划线)。
[0023]PCR反应体系:第一步模板为W3110细菌DNA，第二步PCR模板为第一步PCR产物。 H2O 42 u I
IOXPfu Buffer 5 U I IOmM dNTPI U I
Template100 ng
Primers0.2 u I
PfuI u I
Total50 u I
PCR条件采用程序:
95°C 5 min ； 95°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 30 sec，30 循环；72°C 2min 延伸。
PCR产物取2 u I凝胶电泳，条带清晰单一。
[0024]2、纯化步骤I第二步PCR产物。PCR产物加5 M NH4Ac 5 U 1，混合后，加125 U I100% 乙醇，一80°C 4 h，14，000 rpm,4°C,30 min。弃上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000rpm,4°C, 15 min。弃上清,沉淀溶解在ddH20。
`[0025]3、EcoRI和BamHI双酶切步骤2纯化的DNA片段。
酶切体系为:
步骤3纯化的DNA片段0.4 ii g (I ill)
BSA0.5 u I
EcoRI0.5 u I
BamHI0.5 u I
IOXNEBBuffer 25 u I
H2O42.5 u I
37V, 2 ho
[0026]4、1.5%琼脂糖凝胶电泳,用QIAquick Gel Extraction Kit,进行胶回收DNA片段。
[0027]5、EcoRI 和 BamHI 双酶切 pBluescript SK (-)，酶切体系为: pBluescript SK (-)0.4 Hg (I U I)
BSA0.5 u I
EcoRI0.5 u I
BamHI0.5 U I
10XNEBBuffer25 U I
H2O42.5 u I
37。。，2 ho
[0028]6、回收步骤 4 得到的 EcoRI 或 BamHI 线性 pBluescript SK(_)质粒。加 5 M NH4Ac5 yl，混合后，加 125 u I 100% 乙醇，一80°C，4 h ；14, 000 rpm，4°C，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH20。[0029]7、T4DNA连接酶连接步骤4 EcoRI单酶切DNA片段和步骤6 DNA片段，连接反应体系20 yl，T4DNA连接酶I yl，16°C过夜。
[0030]8、连接产物 Iii I 和 10 ill 电转感受态(One Shot? TOPlO Electrocomp E.coli, Cat# C404050, Invitrogen, CA, USA)混合，混合物转到冰冷的 2 mm 电转杯(Cat#4307 000.593, Eppendorf, Hamburg, Germany)。电转装置 Gibco BRL Cell PoratorElectroporation System (cat# 71600-050 和 11609-039，Gibco BRL)。设置:4 k 欧，330 u F, fast charge 400 kV电击。电击后，混合物转入LB培养液0.3 ml中，225 rpm,37°C，1 h。取适量，接种氨苄抗性培养皿，37°C，12-16h。
[0031]9、鉴定。菌落PCR粗步鉴定含正确插入子菌落，得到含pgalK质粒转化子菌落。细菌扩增，提取质粒，测序验证。保存转化PgalK菌种。
[0032]实施例2-4以小鼠多巴胺转运体DAT基因(mDAT)为例，应用BAC重组技术，把IRES-G-1uc重组在小鼠染色体DAT基因的第15个外显子的终止密码子后。构建mDAT完整基因和IRES-G-1uc BAC重组体。BAC重组和galK阳性选择和阴性选择流程示意图见图1o
[0033]实施例2 构建 pBACe3.6_AC154547_galK
I)pBACe3.6-AC154547 转化 SW102。
①抽提 pBACe3.6-AC154547 QIAGEN Large-Construct Kit (Cat# 12462 QIAGEN 德国)试剂盒，按操作步骤进行。
[0034]②制备SW102电转感受态
a.用枪头挑新鲜单克隆SW102菌落，接种至盛有Iml LB (含12.5 u g/ml四环素)液体培养基的15 ml离心管中。
b.32°C, 220 rpm，培养 14_16h。
c.第二天，以1:100的比例，将取0.5 ml菌液至50 ml LB (含12.5 u g/ml四环素)液体培养基中，32 °C，220 rpm，振摇2_3h，当OD值达到0.5-0.6时，停止培养。
d.将菌液在冰上预冷lOmin，随后将菌液分装到25ml预冷的离心杯中，4°C，5000 rpm离心IOmin0
e.弃上清，离心管中加入少量冰ddH20，冰上，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4°C，4000 rpm离心5min。重复一次。
f.弃上清，每个离心管中加入冰50u I ddH20。
[0035]③电转化25 U I感受态加5 U I (2u g) pBACe3.6-AC154547，温和混匀，混合物转到冰冷的2 mm电转杯。电转装置和设置同实施例1步骤8。电击后，混合物转入300 U I的LB液体培养基，32 0C，220-250 rpm复苏Ih。接种在含32 u g/ml氯霉素和12.5 y g/ml四环素的培养皿上，32°C培养，18-24h。保存转化pBACe3.6-AC154547的SW102。
[0036]2) PCR扩增含同源臂galK双链DNA。
以实施例1得到的PgalK为模板，根据NCBI genebank数据库所示目的基因序列设计拟插入位点，设计含同源臂hF (50 bp)和hR (50 bp)，用于扩增galK的引物，PCR获得含目的基因DAT同源臂hF和载体同源臂hR的galKDNA片段。
设计含同源臂hF和hR，用于扩增galK的引物:
homology arm F-F: CTC AAG GCT CAG CCC AAC TCT GCA ACT GTT CTC TTC TGC TCTGTC CTG CAC CTG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CA (同源臂 hF，下划线)
homology arm R-R: TGC TGC TGT TTA GGG ATC TGC AGC ATA TCA TGG CGT GTA ATATGA GAG ACT CAG CAC TGT CCT GCT CCT T (同源臂 hR，下划线) PCR反应体系:
Fermentals fast PCR mix10 u I
Primers (50 mM)0.2 u I
pgalK 100 ng0.1 u I
H2O9.7 u I
Total20 u I
PCR反应程序:
95°C 5 min,95°C I sec,60°C 5sec,72°C 20 sec,40 cycle。72°C 3min。
[0037]3) 1.5%琼脂糖凝胶电泳,用QIAquick Gel Extraction Kit,进行胶回收DNA片段。
[0038]4)制备步骤I)得到的转化pBACe3.6-AC154547的SW102电转感受态。方法步骤同I)②。
[0039]5 ) BAC重组和galK阳性选择。
步骤3)得到的DNA片段2 Ul,电转化步骤4)得到的电转感受态，电转化操作同步骤
I)③。电转化后，混合物转入LB培养液0.3 ml中，细菌42°C，15min，225 rpm, 32°C I h。M9盐溶液洗2次后，接种galK阳性选择培养皿，32 °C，72h。galK阳性选择培养皿制备:
陋:........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................]丨—^..........................................................................................1
—11 Bg I
A itilodaweect|
5k M63 (autoclai/ed)20 ml
IM MgSCV.7HjO (autodaved)0 I ml
[***...........................................................................................................................................................................................................*][***Frn1..............................................*]
[SO mg/iri L4ajtcifie(Sltarile filteiieil)~|| 45cT|J|
32 mg/M Chlorainphetu col100 ti_
6)galK阳性选择培养皿得到的克隆，MacConkey培养板划线，再次选择取红色克隆1，2,3,4.鉴定。细菌扩增，提取质粒，PCR初步证实得到pBACe3.6_AC154547_galK重组子菌落。测序验证。保存含pBACe3.6-AC154547-galK重组子菌种。
[0040]实施例3 构建打靶质粒 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc。
由于 AC154547 上 mDAT 缺少 3’ mDAT (8 kb)。AC158359.2 含 mDAT 3’ 8 kb。以AC158359.2为模板，克隆同源臂HR和3’mDAT (8 kb、同源臂HF位于mDAT，同源臂R位于载体)入pNEB193，并在mDAT第15外显子终止密码子(taa)后，克隆入IRES和G-luc。构建 PNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 质粒。
[0041]I)以AC158359.2为模板，克隆终止密码子taa前3’mDAT (2 kb，含同源臂HF 420bp)入 pNEB193 的 AscI 位点(引物 Fl，Rl )。引物 Fl:AAATAAGGCGCGCCTTTCACTATGTAATTCTGGC(Ascl.下划线)
引物 Rl =AAATAAGGCGCGCCg^rCTTTACACCAACAGCCAATGGC (Ascl,下划线斜
体)
2)以pBACe3.6_AC154547_galK为模板，克隆同源臂HR (420 bp)入步骤I)得到的质粒的PacI位点。
引物 F2:ttttttTTAATTAAg61?ga7ga}AGCGACTCAAGCCTTCGCG (Pacl.下划线；Not I,斜
体)
引物 R2:ttttttTTAATTAA ATTCTTGCGTCTGATCTTTC (Pacl,下划线)。
[0042]3)以pIRES2-EGPF为模板，克隆IRES，入步骤2)得到的质粒的BamHI位点。
引物 F3 AtttttGfi^CTGCCCC TCTCCCTCCC CCCCCCCTAA (BamHI,斜体)
引物 R3:ttttttg^ra7CCATGGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGG (BamHI,斜体；NcoI,下划
线)
4)以AC158359.2为模板，克隆终止密码子taa后3’mDAT (7.4 kb)入步骤3)得到的质粒的NcoI和NotI位点(引物F3, R3)。
引物 F4:ttttttCCATGGAGTGGAAGGAGACAGCTGCC (Ncol,下划线)
引物 R4:ttttttGCGGCC GCGAAAACGAATTCGCCCTTGGCCG (Notl,下划线)。
[0043]5)以 pMCS-Gaussia-Luc 载体(ThermoFisher)为模板，克隆 G-luc 入步骤 4)得到质粒的 NcoI 位点，形成 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 打靶质粒(12 kb)。
引物 F5:ttttttCCATGGGAGTCAAAGTTCTG (Ncol,下划线)
引物 R5:ttttttCCATGGTTAGTCACCACCGGCCCCCT (Ncol,下划线)。
[0044]实施例4 构建重组体 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc。
1)AscI/PacI 双酶切 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 打靶质粒(12 kb)，得到含同源臂 HFR-3’mDAT-1RES-G-luc 片段(9 kb)。
2)制备实施例2得到的含pBACe3.6_AC154547_galK重组子菌种SW102电转感受态。方法步骤同实施例2，步骤I)②。
3)步骤I)得到的DNA片段5Ul,电转化步骤2)得到的电转感受态，电转化操作同实施例2，步骤I)③。电转化后，混合物转入LB培养液0.3 ml中，细菌42°C，15min。225rpm, 32°C 4 h。M9盐溶液洗2次后，接种galK阴性选择培养皿，32°C，72h。
galK阴性性选择培养皿制备:
fT^0.......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................[[......160M......................................1 A評Il 3 g
Auiodavg-1
5>: M6J (autoclaired)40 ml
IM MgSQig-THaO (aiiiodaveci)_ 0 2 ml
20% 2 -decixy- g^tacios e (amio clave c
50%g}ycerol (aulodaved)800 ul
I ml
L-toanelrsteite"
[34mgtei~~] | 2:0 0(il~galK阴性选择培养皿得到的克隆，细菌扩增，提取质粒，分段多步PCR初步证实得到pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc 重组子菌落。见图 2。
[0045]分段PCR引物如下:
第一对引物 1-F 5’ -tgttgatgcaaaccccagag _3 ’(位于 HF 前 199 bp 处)和 1-R5’ -gcaacagcaatgaggacagc-3’ (位于插入子 5’)。扩增子 1227 bp。
第二对引物 2_F 5’ tggaagatccagcaatacgg-3 ’(位于插入子 3’ 端)和 2~R5’ -ccgttcgctaactcagcatc-3’(位于载体 HR 后 445 bp)，扩增子 1488 bp。
第三对引物 3-F 5 ’ gggctgaactcaggttgtgg-3 ’ 3-R 5 ’-aggccaggcatcattcttga-3 ’ 位于插入子，扩增子 1926 bp。
SmaI酶切，证实重组正确。
pBACe3.6-AC154547 和 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc SmaI 酶切预测见下表。
【权利要求】
1.一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于重组位点是目的基因的最后一个外显子的终止密码子后，把IRES-报告基因重组在目的基因的最后一个外显子的终止密码子后，该重组方法为目的基因的表达调控研究提供完全天然的染色体环境。
2.权利要求1所述的一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于重组后，目的基因和报告基因一起转录成融合的mRNA，目的基因mRNA各外显子剪接正确。
3.权利要求2所述的一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于报告基因与目的基因融合的mRNA，分别翻译成报告基因蛋白和目的基因蛋白。
4.权利要求1所述的一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于重组方法中的IRES，报告基因可以从市售报告基因质粒获得。
5.权利要求4所述的一种建立报告基因重组在染色体目的基因上的方法，其特征在于市售报告基因质粒可以是荧光素酶系列报告基因质粒，荧光蛋白系列报告基因质粒，分泌性碱性磷酸酶系列报告基因质粒。
【文档编号】C12N15/85GK103484496SQ201310327687
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】赵营, 翟德胜, 武俊芳, 宋向凤, 许重洁, 赵德安, 李嵩箕, 谷争, 袁会峰, 赵繁荣, 王小引 申请人:新乡医学院