一种来源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种新型葡糖淀粉酶及其应用。所述葡糖淀粉酶来源于黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum），本发明通过基因工程手段，将葡糖淀粉酶的基因转化入黑曲霉（Aspergillus niger）中，从而构建了能高效表达葡糖淀粉酶的黑曲霉工程菌株，以弥补现有技术的不足。本发明首次公开了黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶基因，并通过构建黑曲霉工程菌株，能在体外高效重组表达葡糖淀粉酶，摇瓶发酵酶活高达664U/mL。本发明所述葡糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，水解出葡萄糖，可广泛应用于淀粉糖工业。
【专利说明】一种来源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种来源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶及 其应用。
【背景技术】
[0002] 葡糖淀粉酶（Glucoamylase，EC3. 2. 1. 3)，是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀 粉从非还原性未端水解a-1. 4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1. 6葡萄糖苷键， 转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，从糖原的非还原末端释放P-D-葡萄糖。
[0003] 多种细菌、真菌、酵母和植物都生产葡糖淀粉酶。特别有趣且商业上重要的 葡糖淀粉酶是在细胞外产生的真菌的酶，例如来自下列的菌株：曲霉属（Aspergillus) (Svenssonetal.,CarlsbergRes.Commun. 48:529-544(1983);Boeletal. ,EMBO J.3:1097-1102(1984);Hayashidaetal.，Agric.Biol.Chem. 53: 923-929(1989);美 国专利号 5,024,941;美国专利号 4,794，175和1088/09795);蓝状菌属（1&131'〇11^〇68) (美国专利号4, 247, 637;美国专利号6, 255, 084;和美国专利号6, 620, 924);根霉属 (Rhizopus)(Ashikarietal. ,Agric.Biol.Chem. 50: 957-964 (1986);Ashikari etal.,App.Microbio.Biotech. 32: 129-133 (1989)和美国专利号 4,863,864);腐 质霉属（Humicola) (W0 05/052148和美国专利号4, 618, 579);以及毛霉属（Mucor) (Houghton-Larsenetal.，Appl.Microbiol.Biotechnol. 62:210-217(2003)。已在酵 母、真菌和/或细菌细胞中克隆和表达了许多编码这些酶的基因。
[0004] 到目前为止，尚未有关于黑葡萄穗霉（Stachybotryschartarum)中葡糖淀粉酶基 因的研究报道。本发明对葡萄穗霉进行全基因组分析得到编码葡糖淀粉酶的基因，并将该 基因在黑曲霉中表达，筛选得到高效表达葡糖淀粉酶的生物工程菌株，从而为高密度发酵 和工业化生产奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型葡糖淀粉酶及其应用。所述葡糖淀粉酶来源于黑葡 萄穗霉（Stachybotryschartarum),本发明通过基因工程手段，将葡糖淀粉酶的基因转化 入黑曲霉（Aspergillusniger)中，从而构建了能高效表达葡糖淀粉酶的黑曲霉工程菌株， 以弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明一个方面提供一种新型的葡糖淀粉酶，其特征在于：
[0007] 1)其氨基酸序列为SEQIDNO: 1的葡糖淀粉酶；
[0008] 2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中 葡糖淀粉酶活性的酶。
[0009] 本发明另一方面提供了编码上述葡糖淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQID NO: 2。
[0010] 本发明提供了一种用于表达氨基酸序列为SEQIDNO: 1的葡糖淀粉酶的重组表 达载体，
[0011] 本发明另一方面提供了一种重组工程菌，其携带有表达上述葡糖淀粉酶基因的重 组表达载体的宿主细胞。
[0012] 上述表达宿主细胞为黑曲霉。
[0013] 本发明的葡糖淀粉酶及上述的重组工程菌用于制备葡萄糖。
[0014] 本发明首次公开了黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶基因，并通过构建黑曲霉工程菌株， 能在体外高效重组表达葡糖淀粉酶，摇瓶发酵酶活高达664U/mL。本发明所述葡糖淀粉酶能 从糖链的非还原端高效分解a-1，4-糖苷键，水解出葡萄糖，可广泛应用于淀粉糖工业。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1:本发明构建的pGm_Gla573重组表达载体质粒图谱。
[0016] 图2:黑曲霉XUJ-1发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指95kD处为重 组表达的葡糖淀粉酶。
[0017] 图3:重组表达的葡糖淀粉酶相对酶活-温度曲线图。
[0018] 图4:重组表达的葡糖淀粉酶相对酶活-pH曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文 献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的 任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0020] 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领 域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULAR BIOLOGY, 3ndEd.(Singletonetal.，2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleet al.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0021] 除非另作说明，核酸是按5'至3'方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的 方向从左至右书写。
[0022] 如本文所用，术语"重组"当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核 酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此， 例如，重组细胞是表达在天然（非重组）形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基 因。
[0023] 术语"蛋白质"和"多肽"在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的 单字母或三字母代码。
[0024] 如本文所用，术语"基因"指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的 区域，以及各编码片段（外显子）之间的插入序列（内含子）。
[0025] 术语"核酸"包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
[0026] 术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互换使用。
[0027] 术语"载体"指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载 体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
[0028] 术语"表达载体"表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接 于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录 的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增 强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
[0029] 术语"启动子"表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子 可以是诱导型启动子或组成型启动子。
[0030] 与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个 序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。
[0031] 由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸， 本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0032] 术语"宿主菌株"或"宿主细胞"是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表 达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是 丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。 术语"宿主菌株"或"宿主细胞"指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。
[0033] 在本发明中，宿主细胞为曲霉属某种（Aspergillussp.)(例如棒曲霉（A. clavatus)、烟曲霉（A.fumigatus)、泡盛曲霉（A.awamori)、黄曲霉（A.flavus)，土 曲霉（A.terreus)和米曲霉（A.oryzae))、青霉属某种（Penicilliumsp.)(例如产黄 青霉（P.chrysogenum))、新萨托菌属某种（Neosartoryasp.)(例如费希新萨托菌（N. fischeri))、粘帚霉菌属某种（Gliocladiumsp.)(例如粉红粘帚霉（G.roseum))、木霉属 某种（Trichodermasp.)(例如里氏木霉（T.reesei)、绿色木霉（T.viride)、康宁木霉 (T.koningii)、哈茨木霉（T.harzianum))、腐质霉属某种（Humicolasp.)(例如特异腐质 霉（H.insolens)和灰腐质霉（H.grisea))、金孢霉属某种（Chrysosporiumsp.)、镰刀菌 属某种（Fusariumsp.)、脉孢霉属某种（Neurosporasp.)、肉座菌属某种（Hypocreasp.) 和裸孢壳属某种（Emericellasp.)的细胞。
[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0035] 实施例1:葡糖淀粉酶基因的克隆
[0036] 使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组 DNA。
[0037] 以黑葡萄穗霉基因组DNA为扩增模板扩增黑葡萄穗霉中的葡糖淀粉酶基因，其中 所用到的正向引物P573-F序列为（下划线所示序列为Aflll酶切位点）；
[0038]5' -AACTTAAGATCATGCTGACTTCGAACCTCGT-3，，
[0039] 反向引物P573-R序列为（下划线所示序列为Xbal酶切位点）：
[0040]5' -TGCTCTAGATTATGCCCTGGACATGAC-3，
[0041] 将该基因用PhusionDNA聚合酶（Thermoscientific)从黑葡萄穗霉基因组DNA 中扩增出来。
[0042] 使用凝胶纯化试剂盒（Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶 Aflll和Xbal(Fermentas)对纯化后的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶Aflll 和Xbal对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连 接酶（Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5a大肠杆菌 (Transgen)，用氨节青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen)。测 序结果显示，黑葡萄穗霉中葡糖淀粉酶的基因序列为SEQIDNO:2，，其编码的氨基酸序列 为SEQIDNO: 1 ;多个克隆的测序结果都一致。
[0043] 通过NCBI中的BLAST进行蛋白质序列比对发现，本发明的葡糖淀粉酶为一新的等 位基因，与现有的葡糖淀粉酶序列有明显的区别。
[0044] 使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒。所得1个重组质粒为pGm-Gla573 (见图1)，
[0045] 实施例2 :PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉及验证
[0046] 吸取黑曲霉GAP1孢子悬浮液于CMA平板中心（9cm培养皿），待菌落长满整个培 养皿，切1/4大小的培养基于200mLCMA液体培养基中，在30°C、200rpm的条件培养14~16 h〇
[0047] 用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过 的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30°C、200rpm的条件下温浴1~2h，用显微镜观 察检测原生质体转化进展。
[0048] 用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生 质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45 mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀 两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再 次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体 数目在1X107个/mL左右。
[0049] 在冰上，将100UL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化 反应用1管，加入10Ug重组质粒pGm-Gla573,加入12. 5iiL溶液C，温和混匀后再冰上 放置20min。
[0050] 将丽SA顶层琼脂试管熔化并保持在55°C。从冰中移出上述15mL离心管，并向管 中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3 个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上， 并将平板在30°C下培养疒10d至有转化子长出。
[0051] 按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA，以此为模板，利用实施例1中引物 进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为98°C30S;98°C10S，53°C30S，72°C120S，30个 循环；72°C10min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，经过PCR反 应选育和测序验证阳性转化子。所获得的阳性工程菌命名为黑曲霉XUJ-1(Aspergillus nigerXUJ-1)。
[0052]溶液A:2. 5mL1MK2HP04,2. 5mL1MKH2P04,48. 156gMgS04,加入dlH20 至终体 积500mL，用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌。
[0053]溶液B:5mL1MTris(pH7.5)，2.77gCaCl2，109.32g山梨醇，加入(111120至 终体积500mL，用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌。
[0054]溶液C:250gPEG4000,2. 77gCaCl2,5mL1MTris(pH7. 5)，加入dlH20 至终 体积500mL，用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌。
[0055]原生质体化溶液：将 0? 6g裂解酶（LysingEnzymefromTrichoderma harzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0. 22iim的微孔滤膜过滤除菌。
[0056]MMSA平板：0?59g乙酰胺（Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKC1，1.52g KH2P04,218.5g山梨醇，1ml微量元素（见下），20g琼脂，加入dlH20至终体积972.5mL， 高压蒸汽灭菌后加入用〇. 22ym的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20% MgS04。
[0057]MMSA顶层琼脂试管：0?59g乙酰胺（Sigma)，3. 4gCsCl(Sigma)，0?52gKC1, 1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，1ml微量元素（见下），10g低熔点琼脂糖，加入dlH20至 终体积972. 5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0. 22ym的微孔滤膜过滤除 菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20%MgS04，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。
[0058]微量元素：在 250mLdlH20 中加入 1gFeS04 ? 7H20,8. 8gZnS04 ? 7H20,0? 4g CuS04 ? 5H20,0. 15gMnS04 ? 4H20,0. 1gNa2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6M〇7024 ? 4H20,0. 2mL 浓HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌。
[0059]CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终 体积1000mL，高压蒸气灭菌。
[0060]CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH20至终体积 1000mL，高压蒸气灭菌。
[0061] 实施例3:黑曲霉工程菌的发酵和酶的表达
[0062] 挑取实施例2获得的阳性转化子黑曲霉XUJ-1，接种于30mLTSB发酵培养基中， 在30°C，200rpm的条件下培养5d;所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000g条件下 离心10min，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳。结果如图2 所示，泳道1、泳道2所示均为黑曲霉宿主蛋白表达情况；泳道3所示为本发明黑曲霉XUJ-1 蛋白表达情况，其中箭头所指95kDa处有目的蛋白条带，与预期相符，说明本发明的葡糖淀 粉酶在黑曲霉中得到成功表达，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio)测定显示其表达 量约为6g/L。
[0063]TSB发酵培养基：12gNaN03,0. 5gKC1，1. 5gKH2P04,2 . 05gMgS04.7H20,3. 5g NaH2P04*H20,45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，1g吐温80，1mL微量元素（见下）， 加入dlH20至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用0. 22ym的微孔滤膜过滤除 菌的40%麦芽糖。
[0064]微量元素：在 250mLdlH20 中加入 1gFeS04 ? 7H20,8. 8gZnS04 ? 7H20,0? 4g CuS04 ? 5H20,0. 15gMnS04 ? 4H20,0. 1gNa2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6M〇7024 ? 4H20,0. 2mL 浓HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌。
[0065] 实施例4:葡糖淀粉酶酶活测定
[0066] 1、酶活测定方法
[0067]甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0. 1M乙 酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4. 6);于40±0. 2°C的恒温水浴中预热5?lOmin。在甲管中加入 酶制备液2.OmL摇匀并立即记时；反应lh后，立即在甲、乙两管各加0. 2mL的20%氢氧化 钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2. 0mL(作为对 照）。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入0. 1N碘液10mL，再加0. 1N氢氧 化钠溶液15mL(边加边摇晃），放置暗处15min，加入2N硫酸2mL;最后用0. 05N硫代硫酸 钠溶液滴定至无色为终点。
[0068]酶活X= (A-B)XNX90.05Xn[0069]其中：X-酶活力单位，U/g(mL);
[0070]A--空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；
[0071] B--样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；
[0072]N--硫代硫酸钠溶液的当量浓度；
[0073] n--稀释倍数；
[0074] 90. 05--lmLIN硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数；
[0075] 2、酶活测定
[0076] 按照上述测定方法，取1ml上述发酵上清液进行酶活测定。结果显示其酶活为 664U/mL，说明葡糖淀粉酶基因在黑曲霉中得到高效表达。
[0077]实施例5葡糖淀粉酶酶学性质分析
[0078]在pH4. 6 条件下，分别在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、 75°C条件下测定上述发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图3所 示，本发明的葡糖淀粉酶的最适作用温度为50°C。
[0079]在 40°C条件下，分别用pH为 2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、8. 0 的缓 冲液稀释上述发酵上清液，测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图4所示， 本发明的葡糖淀粉酶的最适作用pH为5. 5。
[0080] 实施例6:转糖实验
[0081] 取l〇ml液化淀粉，加入2ml上述摇瓶发酵的上清液，即葡糖淀粉酶，50°C，pH5. 5条 件下作用30分钟后，测定反应液的DE值(还原性糖值)，结果达到91%。实验结果表明，本发 明的葡糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解a-1，4-糖苷键来水解出葡萄糖。因此，本 发明筛选的葡糖淀粉酶，以及构建的重组表达工程菌可广泛应用于淀粉糖工业。
【权利要求】
1. 一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述的葡糖淀粉酶包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡糖淀粉酶； 2) 在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中葡糖 淀粉酶活性的酶。
2. -种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的葡糖淀粉酶。
3. 如权利要求2所述的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
4. 重组表达载体，所说的重组表达载体用于表达权利要求1所述的葡糖淀粉酶。
5. -种重组工程菌，所述的重组工程菌为携带有权利要求4所述的重组表达载体的宿 主细胞。
6. 如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于所述的宿主细胞为黑曲霉。
7. 权利要求1所述的葡糖淀粉酶在制备葡萄糖中的应用。
8. 权利要求5所述的重组工程菌在制备葡萄糖中的应用。
【文档编号】C12N9/30GK104342419SQ201310337807
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】王华明, 徐娟, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司