一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法
【专利摘要】一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法，首先用磁珠固定化交联蛋白酶，然后利用固定化蛋白酶水解蛋清蛋白，水解液经活性炭脱腥后在60-70℃下进行真空浓缩，再利用冷冻干燥得到含水量小于5%的蛋清蛋白粉。本发明所得蛋清蛋白粉致敏性低，且含有大量的肽类和人体所需的氨基酸，极易被人体吸收，无不良风味；具有良好的推广和应用前景，可广泛用于食品、药品等领域，特别适用作过敏患者的食品原料。
【专利说明】一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋制品加工【技术领域】，涉及低过敏蛋清蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]食物过敏是机体对某些食物产生的一种不良反应，现已成为全球普遍存在的一个食品安全问题。在食物过敏反应中，鸡蛋是FA0/WH0认定的导致人类过敏的8大类食物之一，位居食物过敏排行榜第二。据统计，全世界有0.5%?2.5%的儿童对鸡蛋过敏，在临床上表现为荨麻疹、哮喘、腹痛和腹泻等症状，严重影响着过敏患儿的身体健康和成长。
[0003]迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用含鸡蛋的食物是过敏患者的最佳选择。但鸡蛋常被添加到多种食品中，完全避免食用鸡蛋很困难；而且对鸡蛋过敏程度低的患者来说，也不是最佳办法。目前，主要通过水解法、热处理、糖基化反应及发酵等加工方法降低鸡蛋过敏原性，以减少鸡蛋过敏的发生。选择加工方法降低过敏食物的过敏原性时，同时，还应考虑食品的感官品质和营养价值。在这些加工方法中，水解被认为是降低过敏食物致敏性最有效的方法。过敏原具有表位(线性表位和构象表位)的片段被蛋白酶催化水解后，其致敏性可显著降低；过敏原水解还可能产生具有免疫调节、抗氧化、降血压等功能的生物活性肽，并且其加工特性可以得到改善。但目前，酶水解过敏原仍存在许多亟待解决的关键问题:(1)传统的游离酶水解蛋白过程中，酶会产生自水解片段，干扰下游分析检测；同时，水解反应难以控制，水解反应结束后，酶分离回收存在一定难度，重复利用率低；(2)水解过程中大量疏水基团的暴露，使得水解物带有苦腥味。这些问题困扰着水解并影响着它在降低食物过敏原性方面的广泛应用。
[0004]近些年来，磁性微球作为载体应用于酶固定化领域成为研究热点，将酶固定于磁性微球上，既提高了酶的稳定性，同时还具有易分离、连续重复使用和提高固定化酶催化效率等优点，有利于实现生产工艺的连续化和工业化。鉴于鸡蛋过敏的危害和当前酶水解过敏原工艺中存在的问题。本发明提供了一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法，所述的方法包括:首先用磁珠固定化交联蛋白酶，然后利用固定化蛋白酶水解蛋清蛋白，水解液经活性炭吸附脱腥后在60-70°C下进行真空浓缩，再利用冷冻干燥得到含水量小于5%的蛋清蛋白粉。按照本发明方法所得蛋清蛋白粉致敏性低，且含有大量的肽类和人体所需的氨基酸，极易被人体吸收，无不良风味；具有良好的推广和应用前景，可广泛的用作过敏患者的食品原料。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的在于提供一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法。本发明的水解蛋清粉营养、适口性好、安全性高、致敏性低。
[0006]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下。
[0007](I)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量0.02M PBS缓冲液(PH5.5)溶解，按生物素与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h ;以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意一种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整至酶最适pH值，于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素，透析产物加入甘油于-20°C下保存备用。
[0008](2)链霉亲和素(SA)偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH、HCl及PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液重悬磁珠。按磁珠表面羧基与EDC、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)摩尔比为1:3:3分别加入EDC以及Sulfo-NHS，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。磁珠通过磁架回收，并用PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于PBS缓冲液中。活化后的磁珠加入含SA的PBS缓冲液(pH8.0)中37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的PBS缓冲液(ρΗ8.0)中，4°C保存备用。
[0009](3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:1-1:4，反应在37 °〇下振荡孵育20 min。经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶。
[0010](4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为37-60°C，pH值6.0-8.0，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000-30000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值6.0-8.0，水解时间为2.0-4.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液。
[0011](5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入0.5-3.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液。
[0012](6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
[0013](7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在-40 °C预冻12 h，冷阱温度为_65°C，真空度100 Pa，加热板温度50 °C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
[0014]本发明的优点是:1、本发明能显著降低蛋清蛋白的致敏性；2、本发明提供的蛋清蛋白粉，具有易消化吸收，营养价值高，且无苦腥味和其它不良风味，具有良好的推广和应用前景。
【具体实施方式】
[0015]本发明将通过以下具体实例作进一步说明。
[0016]实施例1。
[0017](I)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量0.02M PBS溶解，按生物素与EDC、NHS摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h ;以木瓜蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整pH值至6.0，于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素。
[0018](2)链霉亲和素(SA)偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH、HCl及PBS溶液洗涤后，用PBS重悬磁珠。按磁珠表面羧基与EDC、Sulfo-NHS摩尔比为1:3:3分别加入EDC以及Sulfo-NHS，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。磁珠通过磁架回收，并用PBS洗涤三次后，重悬于PBS中。活化后的磁珠加入含SA的PBS缓冲液(pH8.0)中37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的PBS (pH8.0)中。
[0019](3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:1，反应在37 °C下振荡孵育20 min。经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶。
[0020](4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为50°C，pH值6.0，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值，水解时间为4.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液。
[0021](5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入0.5%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液。
[0022](6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
[0023](7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在_40°C预冻12 h，冷阱温度为_65°C，真空度100 Pa，加热板温度50 °C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
[0024]实施例2。
[0025](I)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量0.02M PBS(pH5.5)溶解，按生物素与EDC、NHS摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h;以胰蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整PH值至8.0，于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素。
[0026](2)链霉亲和素(SA)偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH、HCl及PBS溶液洗涤后，用PBS重悬磁珠。按磁珠表面羧基与EDC、Sulfo-NHS摩尔比为1:3:3分别加入EDC以及Sulfo-NHS，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。磁珠通过磁架回收，并用PBS洗涤三次后，重悬于PBS中。活化后的磁珠加入含SA的PBS缓冲液(pH8.0)中37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的PBS (pH8.0)中，4°C保存备用。
[0027](3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:2，反应在37 °C下振荡孵育20 min。经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶。
[0028](4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为37°C，pH值8.0，然后按酶活与蛋白底物的比例为10000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值，水解时间为4.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液。
[0029](5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入3.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液。[0030](6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
[0031](7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在-40 °C预冻12 h，冷阱温度为_65°C，真空度100 Pa，加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
[0032]实施例3。
[0033](I)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量0.02M PBS(pH5.5)溶解，按生物素与EDC、NHS摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h;以Flavourzyme风味蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整pH值至7.5，于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素。
[0034](2)链霉亲和素(SA)偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH, HCl及PBS溶液洗涤后，用PBS重悬磁珠。按磁珠表面羧基与EDC、Sulfo-NHS摩尔比为1:3:3分别加入EDC以及Sulfo-NHS，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。磁珠通过磁架回收，并用PBS洗涤三次后，重悬于PBS中。活化后的磁珠加入含SA的PBS缓冲液(pH8.0)中37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的PBS (pH8.0)中，4°C保存备用。
[0035](3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:3，反应在37 °C下振荡孵育20 min。经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶。
[0036](4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为50°C，pH值7.5，然后按酶活与蛋白底物的比例为20000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值，水解时间为3.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液。
[0037](5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入2.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液。
[0038](6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
[0039](7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在_40°C预冻12 h，冷阱温度为_65°C，真空度100 Pa，加热板温度50 °C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
[0040]实施例4。
[0041](I)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量0.02M PBS(pH5.5)溶解，按生物素与EDC、NHS摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h;以Alcalase碱性蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整pH值至8.0,于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素。
[0042](2)链霉亲和素(SA)偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH, HCl及PBS溶液洗涤后，用PBS重悬磁珠。按磁珠表面羧基与EDC、Sulfo-NHS摩尔比为1:3:3分别加入EDC以及Sulfo-NHS，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。磁珠通过磁架回收，并用PBS洗涤三次后，重悬于PBS中。活化后的磁珠加入含SA的PBS缓冲液(pH8.0)中37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的PBS (pH8.0)中。
[0043](3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:4，反应在37 °C下振荡孵育20 min。经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶。
[0044](4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为60°C，pH值8.0，然后按酶活与蛋白底物的比例为30000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值，水解时间为2.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液。
[0045](5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入1.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液。
[0046](6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上。
[0047](7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在-40 °C预冻12 h，冷阱温度为_65°C，真空度100 Pa，加热板温度50 °C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
【权利要求】
1.一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法，其特征是按以下步骤: (1)生物素化标记蛋白酶的制备:称取一定量的生物素，用适量PH5.5、0.02M PBS缓冲液溶解，按生物素与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1:3:3比例混合,于室温下反应1.5 h ;以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意一种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整至酶最适pH值，于4°C下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素，透析产物加入甘油于-20°C下保存备用； (2)链霉亲和素偶联磁珠:取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH、HCl及PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液重悬磁珠，按磁珠表面羧基与1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺摩尔比为1:3:3分别加1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳化二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C振荡反应2 h活化磁珠表面羧基。
2.磁珠通过磁架回收，并用PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于PBS缓冲液中；活化后的磁珠加入含链霉亲和素PH8.0的PBS缓冲液37°C反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h ;磁架回收磁珠，PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的pH8.0的PBS缓冲液中，4°C保存备用； (3)固定化酶的制备:固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为反应在37 °C下振荡孵育20 min，经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶； (4)将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为37-60°C，pH值6.0-8.0,然后按酶活与蛋白底物的比例为5000-30000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的PH值6.0-8.0，水解时间为2.0-4.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液； (5)在步骤(4)收集的蛋清蛋白酶解液中加入0.5-3.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50°C的水浴锅内处理60 min,然后经5000 r/min离心获得上清液； (6)将步骤(5)所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50°C进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上； (7)将步骤(6)所得蛋清水解多肽浓缩物在-40°C预冻12 h，冷阱温度为-65°C，真空度100 Pa，加热板温度50 °C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。
【文档编号】A23J3/34GK103444979SQ201310345347
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】杨安树, 陈红兵, 熊江花, 龙彩云, 佟平, 吴志华, 李欣 申请人:南昌大学