亚麻脂肪酸脱氢酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种能够在哺乳动物中表达的亚麻脂肪酸脱氢酶基因(FAD3)及其应用，所述基因包含SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列。本发明的亚麻脂肪酸脱氢酶基因序列能促进细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸的转化。
【专利说明】亚麻脂肪酸脱氢酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】中的基因工程技术，具体涉及一种亚麻脂肪酸脱氢酶基因密码子及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酸(fatty acid)是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids:PUFAs)含有超过一个(C = C),碳骨架大于18个碳原子的脂肪酸，是组成人体必需的物质，对人体健康非常重要。根据双键的位置不同，将多不饱和脂肪酸分为:《 -6PUFAs和《 -3PUFAs。? -6PUFAs包括、-亚麻酸(Y -LA)、花生四烯酸(AA)、亚油酸(18: 2n-6)等。《_3PUFAs包括a -亚麻酸(a -LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。《_3去饱和酶基因能够把(0-6PUAFS转化为《_3PUAFs，对生物体脂肪酸代谢起到关键作用，包括fatl、FAD3、FAD7、FAD8等，双键引入的位置在第15-16个碳原子之间，又可将此类酶称为A 15去饱和酶。由于植物中?-3PUFAs含量异常的高，说明《_3脂肪酸去饱和酶在植物中的活性相当高；而哺乳动物体内缺乏《_3脂肪酸去饱和酶，自身不能催化合成《_3PUFAs，所以将植物的《-3脂肪酸去饱和酶基因转到哺乳动物中，也许可以得到活性更高的《_3脂肪酸去饱和酶，更加有效的将《-6PUFAs转化为《-3PUFAs。将《_3脂肪酸去饱和酶基因转入哺乳动物细胞中，亚油酸(18: 2n-6)转化为亚麻酸(18: 3n-3)，丰富的亚麻酸(18: 3n_3)可以在哺乳动物自身的去饱和、链延长酶的作用下合成EPA(20: 5n-3)和DHA(22: 6n_3);进而提高o -3PUFAs的整体水平。
[0003]2009 年，日本 Kazuhiro Saeki 研究小组克隆了红亚麻(scarlet flax)的 FAD3B基因，通过人源化改造的FAD3B基因转染牛肌肉卫星细胞后进行成脂诱导；发现hFAD3转基因脂肪细胞系中亚麻酸(18: 3n-3)(增幅0.3% )、DPA(22: 5n_3)(增幅1.5% )与DHA(22: 6n-3)(增幅2.1%)的水平明显增加，亚油酸(18: 2n_6)水平显著下降3%，)-6与《-3PUFAs比值由2.6最低降至1.57 ;并且由对照组细胞与转基因细胞克隆形成的胚胎无形态学上的差异，并且克隆的囊胚率相同。
[0004]以上研究说明，植物源性的去饱和酶基因在动物体内是可以发挥去饱和酶活性改变脂肪酸的组成，而且没有表现出影响机体正常生理功能的征兆。然而，植物源性的基因通常难以在哺乳动物中表达并发挥作用，因此如何对基因序列进行优化，使得其能够在哺乳动物中发挥作用是本领域亟待解决的技术问题，在进行密码子优化过程中面临诸多挑战:首先是如何获得能够表达的基因序列，其次，考虑外源基因mRNA的稳定性和mRNA 二级结构对翻译效率的影响，优化的同时一定要避免阻碍表达的特殊的mRNA的二级结构的形成。上述挑战阻碍了对基因序列的优化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能够在哺乳动物中表达的亚麻脂肪酸脱氢酶基因，所述基因包含SEQ ID N0.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列。
[0006]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的亚麻脂肪酸脱氢酶基因还包括酶切位点，所述的酶切位点位于sEQ ID N0.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列的两，优选的，所述的酶切位点分别是ECORl和BamHl。
[0007]在本发明的另一方面，本发明还涉及含有上述亚麻脂肪酸脱氢酶基因的表达载体。
[0008]在本发明的另一方面，本发明还涉及上述载体在制备转基因哺乳动物或转染哺乳动物细胞中的应用。
[0009]在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体用于哺乳动物或哺乳动物细胞中降低w-6与《-3的比值。
【具体实施方式】
[0010]一、FAD3基因人源化片段的合成
[0011 ] CCGGAATTCttcaaaactgtggctctgcaggaccaaactATGTCCCCTCCCAACTCCATGTCCCCCACCACCAACGGCAACGGTGTGGCTATGAATGGGGCCAAGAAGCAGCTGGATTTTGACCCCTCCGCTGCCCCCCCCTTCAAGATTGCCGACATCCGCGCTGCCATCCCCCCCCACTGCTGGGTGAAGAACCCCTGGCGCTCCCTGTCCTACGTCCTGAGAGACCTGCTGGTCATCCTGTCCTTCGCCGTGGCGGCTGCCAAGCTGGACTCCTGGACTTTCTGGCCCCTGTACTGGGTGGCTCAGGGCACCATGTTCTGGGCCGTCTTTGTGCTGGGCCACGACTGTGGCCATGGCTCCTTCTCCGACATCTGGCTGCTGAACAACGTGATGGGCCACATCCTGCACTCCTCCATCCTGGTGCCC T ACCATGGCTGGAGAATCTCCCACAAGACCCACCACCAGAACCACGGCAATGTGGAGAA G GATGA G TCCTGGGTGCCTCTGCCCGAGAAGGTGTACAAGTCCCTGGACACCTCCACTAA G TTCA T GCGCTTCACCATCCCTCTCCCCATGTTTGCTTATCC T ATCTACCTGTGGACCCGTTCCCCCGG CAAGAAGGGCTCCCACTTCAACCCCTACTCCGACCTGTTCGCCCCCAACGAGCGCGCAGCGGTCCTGATCTCCACCCTGTGCTGGACCGCCATGGCCCTGCTCCTG T GCTACTCCTCCTTCATCTACGGCTTCGCTCCCGTCCTGAAGATCTACGGCGTGCCTTATCTGA TCTTCGTGGC CTGGCTGGGACATGGTGACCT ACCTGCACCACCACGGC T ACGAGCAGAA G CTG C CCTGGTACAGAGGCAAAGAGTG G T C CTAC CTGCGC G G CGGCCTGACCACCGTGGACC GCG ATTACGGCGTCATCAACAACATCCACCACGACATTGGCACCCACGTCATCCACCA C C T CT T CCCTCAGAT G CCCCAC T ATCACCTGGTGGAGGCCACTCAGGCAGCCAAGCA CGT GCTG G G CAA G T ACTACAGAGAGCCCAAGAAATCCGGGCCTTTCCCCTTCCACCTGTTTGGGTAC C TG G TGC G CTC C C T GG G C G AGGATCACTACGTGAGCGACACCGGCGAC G TCG T GTT CTATCAGTCTGA C CC C CACA T T CCCAAGTTCCGCACCAGCTCCGCCACCACCAAGTCCAAGTCCAGCTGAtgatatttggctctgatatatgcaggctgtttatcttgtcctttgttcgtttctttctcccagaaacaaattctctgtttctatgtttctctgtctctcccgcccccagctttctttctgagGGATCCGCG
[0012]其中包括F AD3人源化的序列(下划线部分)，5UTR和3’UTR，两端分别加有ECORl和BamHl酶切位点及保护碱基。将此序列送至takara公司，进行人工合成。
[0013]二、表达载体构建
[0014]1、质粒提取
[0015]将合成的FAD3基因连接到PMDlOT-Simple载体中，挑取穿刺菌加入到LB液体培养基中37°C摇菌14-16h。
[0016]质粒提取方法具体步骤如下:[0017]收集菌液于EP管中，5000rpm离心lmin，弃去上清，加入150 U I重悬液，充分震荡；加入250 u I裂解液，反复颠倒混匀；加入350 u I中和液，反复颠倒混匀；14，OOOrpm离心5min ;将上清移至吸附柱中，14，OOOrpm离心lmin,弃去废液；加入500 U I洗涤液，14，OOOrpm离心lmin，弃去废液，并重复I次；再次离心离心柱_收集管组合lmin，以使残留的清洗液充分挥发。小心地将小柱转入干净的1.5ml离心管，加50ul无R N A酶水到小柱中央，室温孵育Imin后，14，OOOrpm离心lmin。丢弃小柱，将装有FAD3基因片段的洗脱液保存于_20°C。
[0018]2、FAD3片段回收
[0019]FAD3基因通过ECORl和BamHl双酶切，酶切体系如下:
【权利要求】
1.一种能够在哺乳动物中表达的亚麻脂肪酸脱氢酶基因(FAD3)，所述基因包含SEQ IDN0.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的亚麻脂肪酸脱氢酶基因，所述的亚麻脂肪酸脱氢酶基因还包括酶切位点，所述的酶切位点位于SEQ ID N0.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列的两，优选的，所述的酶切位点分别是ECORl和BamHl。
3.含有上述亚麻脂肪酸脱氢酶基因序列的表达载体。
4.上述载体在制备转基因哺乳动物或转染哺乳动物细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述 的英语，所述的载体用于哺乳动物或哺乳动物细胞中降低《-6与《-3的比值或者促进细胞内n-6向n-3脂肪酸的转化。
【文档编号】C12N15/63GK103451205SQ201310344833
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月3日 优先权日:2013年8月3日
【发明者】李光鹏, 左永春, 魏著英, 扈廷茂 申请人:内蒙古大学