一种嗜热一氧化碳链霉菌新菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜热一氧化碳链霉菌（Streptomyces?thermocarboxydus）新菌株CF1，其保藏号为CGMCC?No.6873，保藏日期为2012年11月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还公开了含有其的菌剂。在堆体中接种本发明的嗜热一氧化碳链霉菌新菌株CF1，在北方低温季节能迅速提高堆体温度，且能使堆体保持50℃以上的高温15天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥产物养分含量高，pH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。
【专利说明】一种嗜热一氧化碳链霉菌新菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于土壤肥料领域，具体涉及一种农用微生物制剂及其应用。
【背景技术】
[0002]随着社会经济的高速发展，人们的生活水平不断提高，饮食结构发生了巨大的变化，其中畜禽产品在饮食结构中占据着不可缺少的重要作用，由此推动了畜禽养殖业的迅猛发展。近二十年，一批集约化程度越来越高的养殖场纷纷在政府的大力支持下在方便运输的城市近远郊建立，饲养数量由少变多，大量的畜禽粪便因没有及时无害化处理而随意丢弃在自然环境中，造成了资源的极大浪费和环境污染。在满足了人们对肉、蛋、乳需求的同时，给我国的自然生态环境带来了巨大的压力，导致严重的污染。
【发明内容】
[0003]本发明首先提供嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)新菌株CFl。
[0004]本发明还提供含有嗜热一氧化碳链霉菌CFl的菌剂。
[0005]本发明的菌株分离与筛选过程如下:
[0006]①采用平板稀释法分别从新鲜牛粪、高温发酵阶段牛粪以及腐熟后的牛粪中进行微生物分离。称取各样品各IOg分别放入装有90mL无菌水的三角瓶中，在摇床上振荡30min，使样品充分分散，静置20min后即为KT1稀释液，然后连续稀释制成10_2_10_8浓度的稀释液备用。取100 μ L各浓度的稀释液，采用常规涂抹法用涂布器在高氏I号固体培养基上涂布，每个浓度梯度三个重`复，分别置于25°C、30°C、50°C恒温培养箱中培养。3d后挑取平板上长出的单菌落，进一步纯化培养，并于4°C保存。
[0007]高氏I 号培养基为可溶性淀粉 20.0g/L、KN03 1.0g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4.7H20
0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、水 1000ml, pH7.2-7.4、琼脂 1.5%-2.0%。
[0008]②根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株高温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第5天D/d达到11.3。该菌株菌落近圆形，表面绒毛状、松散、边缘菌丝较紧密，呈灰色；基部颜色浅褐色。
[0009]③利用16SrDNA-PCR技术对该菌株进行分子生物学鉴定，测定了 16SrDNA的序列，序列如SEQ ID N0.1所示，与其它公布的嗜热一氧化碳链霉菌的16SrDNA的序列同源性为99%,鉴定为嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus),命名为CFl,并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.6873。
[0010]本发明的嗜热一氧化碳链霉菌CFl可制备成菌剂，其中，嗜热一氧化碳链霉菌CFl的活菌数可为50亿/克以上，优选为100亿/克以上。[0011]本发明还提供所述生物菌剂的制备方法，其为在液体发酵培养基中发酵嗜热一氧化碳链霉菌CFl，将得到的发酵液即为生物菌剂。
[0012]其中，优选的发酵培养基为高氏I号液体培养基。
[0013]优选的，所述的制备方法可具体包括如下步骤:
[0014]将嗜热一氧化碳链霉菌CFl接种至高氏I号固体培养基斜面，于50°C恒温条件培养48-72h得到斜面种子；
[0015]将斜面种子接种至高氏I号液体培养基，于50°C恒温条件，120-200r/min转速振荡培养48-72h得到液体种子；
[0016]将液体种子以0.5-10% (V/V，即每100ml液体培养基接种0.5-lOml液体种子)接种量，接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，50°C恒温培养3-4天。培养结束后，将菌种盛放于灭菌的容器内，置于阴凉干燥处保存。
[0017]优选的，还可以根据本领域常规方法将制备的嗜热一氧化碳链霉菌CFl发酵液进行冷冻干燥，从而制备冻干粉形式的生物菌剂。
[0018]进一步的，本发明还提供一种用于动物粪便发酵的复合菌剂，其包括枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和权利要求1所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl。
[0019]其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的巨大芽孢杆菌活菌数为20亿/克以上，所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl的活菌数为20亿/克以上。
[0020]本发明的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均可市售获得，如购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，巨大芽孢杆菌CICC 20611，枯草芽孢杆菌CICC 10090。当然本发明不限于这两种菌株。`
[0021]在堆体中接种本发明的嗜热一氧化碳链霉菌新菌株CF1，能在北方低温季节迅速提高堆体温度，且能使堆体保持50°C以上的高温15天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥结束后养分含量高，PH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。
[0022]在堆体中接种包含本发明的嗜热一氧化碳链霉菌新菌株CFl的复合菌剂，不仅在北方低温季节能迅速提高堆体温度，高温期长，发酵周期缩短，而且堆肥结束后养分含量损失少，产品的养分含量大幅提高，比接种市售EM菌剂和自然堆肥的产品养分含量显著增加。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”；巨大芽孢杆菌菌株CICC20611,枯草芽孢杆菌CICC 10090菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0025]实施例1嗜热一氧化碳链霉菌菌剂的制备
[0026]将嗜热一氧化碳链霉菌CFl接种至高氏I号固体培养基斜面，于50°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0027]将斜面种子接种至高氏I号液体培养基，于50°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0028]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，50°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0029]所述的高氏I号固体培养基成分为:每1000ml蒸馏水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 0.01g，琼脂 20.0g，调节 pH为7.2-7.4。分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。
[0030]所述的高氏I号液体培养基成分为:每1000ml蒸馏水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 0.01g，调节 pH 为 7.0。分装Λ 500ml三角瓶中，每瓶150ml,塞上棉塞，高温高压灭菌20min。
[0031]实施例2
[0032]将新鲜牛粪与粉碎秸杆以干重6:1的比例进行混合，或根据牛粪、锯末的理化性质适当调整比例，使混合物的C/N为30，含水量为60%。
[0033]将实施例1生产的菌剂按照质量比5%。接种到堆料混合物中，定期翻堆通气，进行发酵堆肥发酵。同时以不接入本发明的菌剂的堆体为对照。
[0034]接种本发明所述微生物菌剂的牛粪与自然堆肥的牛粪相比，升温速度快，堆体最高温度高，发酵周期短，其C/N下降迅速，这些结果表明向牛粪中接种本发明所述的微生物菌剂能够加快牛粪堆肥的腐熟程度。
[0035]通过对比分析接种本发明所述微生物菌剂的牛粪与自然堆肥的牛粪堆肥结束后堆料的养分含量，发现接种本发明所述微生物菌剂的牛粪堆肥结束后，其全氮、全磷、全钾以及有机质含量均显著高于自然堆肥的牛粪，这表明向牛粪中接种本发明所述的菌剂更有利于堆肥中养分转化与保存。接种本发明所述微生物菌剂的牛粪与自然堆肥的牛粪在腐熟程度和养分含量各指标上的差别见表1和表2。
[0036]表1本发明所述微生物菌剂对堆肥腐熟程度的影响
菌刺达到55?fC?I堆配结束后
处理天数t取咼温程’C/N
[0037]_建_下天数_
CFl21.565 -2314.8
CK685 8''C3620.4
[0038]堆肥初期菌剂促进分解堆体中游离的营养物质，可以使堆体温度迅速上升，进而又促进微生物的繁殖，对温度上升和微生物繁殖起良性循环作用，推动温度达到最高温度，温度达到最高的时候，是微生物反应最激烈的时候，大量有机质被降解，碳源被转化为CO2,而导致堆体质量下降。温度是堆体内部反应情况的外在表现。温度上升越快、高温持续时间越长，堆体内部被充分反应得越充分，越有利于被固定的养分的释放。在最高温阶段反应越充分，被消耗的游离的营养物质和可降解的有机物质就会越少，不会导致有机肥在施肥后出现烧苗现象。大量有机物在高温阶段被降解后，只有少量的可降解的物质在后面后熟阶段被分解。前期分解的物质越多越充分，后熟分解的就越少越缓和，温度就会越低，最终温度会接近室温。同时高温持续时间长，能够彻底的杀灭动物粪便中的病原物。因此，本发明筛选的嗜热一氧化碳链霉菌CFl是一种优良的高温菌。
[0039]堆肥结束后及时取样，用小土钻钻取堆体表层下40~50cm处样品，风干后研磨，测定有机质、全氮、全磷、全钾含量，见表2。
[0040]表2堆肥样品的养分含量
I全氮(%)全磷(%)全钾(%)Iif
[0041] [0042]实施例3用于动物粪便发酵的复合菌剂
[0043]取过夜培养的枯草芽孢杆菌种子液IOmL转接入500ml发酵培养基，28°C发酵20小时，转速为180rpm。
[0044]枯草芽孢杆菌发酵培养基的组成为:蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉lg/L，七水合硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.0005g/L, pH7.0。
[0045]取过夜培养的巨大芽孢杆菌种子液20mL转接入500ml发酵培养基，30°C条件下，培养48h。转速为180rpm。
[0046]巨大芽孢杆菌发酵培养基组成为:牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
[0047]按实施例1的方法制备嗜热一氧化碳链霉菌CFl的发酵液。
[0048]将制备的枯草芽孢 杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌的发酵液和嗜热一氧化碳链霉菌CFl的发酵液按重量比1:1:2进行混合，即得用于动物粪便发酵的复合菌剂。
[0049]将新鲜牛粪与锯末以干重6:1的比例进行混合，或根据牛粪、锯末的理化性质适当调整比例，使混合物的C/N为30，含水量为60%。
[0050]接种前述的复合菌剂，接种量为0.8%，并以市售的EM菌剂为阳性对照，以不接种菌剂作为阴性对照。结果见表3和表4。
[0051]表3本发明所述复合微生物菌剂对堆肥腐熟程度的影响
菌剂达到飢维=。c 一曰堆肥躲后
处理天数 3最尚温程，rfil°CW CM __下天数_ [0055]由表3可知，接种包含本发明所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl的复合菌剂，堆体可在23天以内完成发酵，比接种市售EM菌剂和自然堆肥提前10-12天完成发酵，且高温持续期长，堆肥结束后腐熟程度好。由表4可知，接种包含本发明所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl的复合菌剂，堆肥结束后堆料中有机质含量、全氮、全磷和全钾含量均高于接种市售EM菌剂和自然堆肥的堆料。其中接种包含本发明所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl的复合菌剂的堆肥产品其有机质含量和总养分含量均高于国家标准(有机肥料NY-525-2012)中的规定，而接种市售EM菌剂的堆肥产品，刚刚达到国家标准(有机肥料NY-525-2012)，自然堆肥的产品未达到国家标准(有机肥料NY-525-2012 )。
[0056]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)新菌株CFl,其保藏号为 CGMCC N0.6873。
2.含有权利要求1所述菌株的生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的生物菌剂，其中嗜热一氧化碳链霉菌CFl的活菌数为50亿/克以上。
4.制备权利要求2或3所述的生物菌剂的方法，其为在液体发酵培养基中发酵嗜热一氧化碳链霉菌CF1，将得到的发酵液即为生物菌剂。
5.如权利要求4所述的方法，其还包括将嗜热一氧化碳链霉菌CFl发酵液进行冷冻干燥，制备成的冻干粉为生物菌剂。
6.一种用于动物粪便发酵的复合菌剂，其包括枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和权利要求I所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl。
7.如权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的巨大芽孢杆菌活菌数为20亿/克以上，所述的嗜热一氧化碳链霉菌CFl的活菌数为20亿/克以上。`
【文档编号】C12R1/125GK103484396SQ201310356764
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】刘克锋, 王顺利, 王红利, 高程达, 石爱平 申请人:北京农学院