一种检测鸡胡须性状的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测鸡胡须性状的方法，涉及分子生物学领域，在胡须鸡27号染色体发现存在三个DNA片段的拷贝数变异，物理位置分别为1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、3578409-3592890bp，确定了3个分子标记，针对该分子标记设计了3对引物，用PCR方法对待测鸡基因组的上述3个分子标记进行检测，若三个PCR扩增反应的目的片段分别为3200bp、501bp、411bp，则检测结果为阳性，否则为阴性。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，可快速检测含有胡须性状的个体，在鸡的保种、育种过程中具有重要应用价值。
【专利说明】一种检测鸡胡须性状的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体涉及用于鸡胡须性状的分子标记、以及检 测胡须性状的方法。
【背景技术】
[0002] 长期的进化和驯化选择，丰富了农业动物遗传资源的多样性。近年来的研究发现， 基因组结构变异是畜禽驯化过程中多个重要性状的遗传基础，如鸡20号染色体上发生的 复杂结构重排，会使EDN3基因的表达产生变化，最终导致黑色素在真皮内的沉积；位于鸡1 号染色体的S0X5基因内含子1内3. 2kb区域的复制，使得在发育的6-12天内S0X5基因表 达发生改变，导致豆冠表型的产生。基因组结构变异可以通过多种机制影响基因表达，对结 构变异进行研究，有助于我们解析相关性状形成的机制。
[0003] 基因组结构变异包括缺失、重复、倒位、易位四种类型。目前针对基因组结构变异 的检测技术主要有基于高密度SNP的基因分型芯片、比较基因组杂交芯片，以及高通量测 序技术等。随着高通量测序技术的不断发展，成本的不断降低，测序已经成为目前生物学研 究的重要手段。通过对结构变异靶区域的重测序分析，分离出结构变异造成的断点和重排 情况，进而利用PCR等常规分子生物学技术对结构变异进行检测。检测只需在结构变异产 生的断点两侧设计扩增引物，利用简单的PCR反应，通过琼脂糖凝胶检测就可以检测结构 变异的存在。
[0004] 鸡的胡须性状是家畜中最早进行研究的表型性状之一，经历了上百年的历史，至 今仍未见报道影响胡须性状的确定染色体位置和检测方法。如果利用传统方法对鸡的胡须 形状进行选育，将耗费大量的人力、物力、财力。利用分子生物学的手段建立一种快速检测 胡须性状的方法，进行标记辅助选择，将有助于提高育种效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鉴别鸡胡须性状性状的方法。
[0006] 本发明以中国农业大学与广东省农业科学院畜牧研究所合作建立的以惠阳胡 须鸡与岭南黄鸡A03系为亲本的F2杂交资源群体为研究对象，记录了F0、F1和F2代 个体的胡须性状，利用全基因组SNP进行连锁分析，将影响鸡胡须性状的基因座定位于 鸡27号染色体；对R)样本的进行重测序分析，分离得到了影响鸡胡须性状的结构变 异。本发明发现，胡须鸡27号染色体存在三个DNA片段的重复(拷贝数变异，CNV)，在鸡 ICGSCGallus_gallus-4.0 版本基因组中的物理位置分别为 1702269-1721521bp(CNV1)、 4470331-4503417bp(CNV2)、3578409-3592890bp(CNV3)，三个片段顺利连接并插入到CNV1 原座位，其位置关系如图1所示。本发明鉴别鸡胡须性状的方法，是针对不同CNV片段间的 连接设计引物进行PCR检测，根据检测结果判定鸡是否存在胡须基因。
[0007] 本发明首先提供一种用于检测鸡胡须性状的分子标记组合，其为CNV1、 CNV2和CNV3,这三个分子标记物理位置位于鸡27号染色体1702269-1721521bp、 4470331-4503417bp、3578409-3592890bp处，CNV1 和CNV2 连接的基因序列如SEQIDNo. 7 所示，CNV2和CNV3连接的基因序列如SEQIDNo. 8所示，CNV3和CNV1连接的基因序列如 SEQIDNo. 9 所示。
[0008] 本发明提供了用于检测上述分子标记组合的引物组合，是针对上述不同CNV片段 间的连接设计引物，其核苷酸序列为：
【权利要求】
1. 一种用于检测鸡胡须性状的分子标记组合，其特征在于，其为CNV1、CNV2和CNV3， 这三个分子标记物理位置位于鸡27号染色体1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、 3578409-3592890bp 处，CNV1 和 CNV2 连接的基因序列如 SEQ ID No. 7 所示，CNV2 和 CNV3 连 接的基因序列如SEQ ID No. 8所示，CNV3和CNV1连接的基因序列如SEQ ID No. 9所示。
2. 权利要求1所述的分子标记组合在鸡育种中的应用。
3. 用于检测权利要求1所述分子标记组合的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列为： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC〇
4. 权利要求3所述的引物组合在制备检测鸡胡须性状试剂盒中的应用。
5. 权利要求3所述的引物组合在鸡育种中的应用。
6. -种检测鸡胡须性状的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物组合。
7. -种检测鸡胡须性状的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用三对引物分别进行PCR反应；所述三对引物分别 是： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC ； (2 )将三次PCR反应的扩增产物用琼脂糖凝胶检测，若CNV1、CNV2、CNV3引物的PCR扩 增反应的目的片段分别为320(^?、50化？、4^?，则结果为阳性，否则为阴性。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R和 CNV2-3F、CNV2-3R的PCR扩增反应体系为： 总体系为25 ill时，基因组DNA :50ng，1 XPCR Buffer，dNTP4mM，上、下游引物各 lOpmol，康为Taq DNA聚合酶1. 25U，加水补至25iil反应体系； 引物 CNV1-2F、CNV1-2R 的 PCR 扩增反应体系为：基因组 DNA:50ng，lXPCR Buffer， dNTP4mM，上、下游引物各10pmol，Long AmpTaq DNA聚合酶NEB1. 25U，加水补至25iil反应 体系。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R及 CNV2-3F、CNV2-3R 的 PCR 反应条件为：94°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，60°C退火 30sec， 72°C延伸20sec，共35个循环；72°C终延伸7min;12°C保存； 引物CNV1-2F、CNV1-2R的PCR反应条件为：94°C预变性3min ;94°C变性lOsec，57°C退 火30sec，65°C延伸4sec，共35个循环；65°C终延伸7min ;12°C保存。
10. 权利要求7-9任一所述的方法在鸡育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104342490SQ201310367724
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】胡晓湘, 顾晓荣, 郭影, 盛哲雅, 王彦强, 舒鼎铭, 瞿浩, 李宁 申请人:中国农业大学