一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法

一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，将EGF—TCSKDEL基因亚克隆至Bac-to-Bac系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，用抽提的质粒DNA转染家蚕细胞BmN，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒，用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，获得大量表达EGF—TCSKDEL融合蛋白；本发明具有较高的表达量和生物活性，为创造新的高活性、高抑瘤率、低免疫原性、小分子量的靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。
【专利说明】—种用家奋杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种表达EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，尤其涉及一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法。
【背景技术】[0002]目前，应用于临床肿瘤治疗的蛋白药物主要有干扰素、白介素等，尽管在临床上已成功的治疗了某些特定来源的肿瘤，但从总体上来说临床疗效一般，同时也产生了严重的毒副作用和剂量依赖性等，且只有部分病人对治疗敏感。因此有必要研究具有更好临床疗效和较小副作用的蛋白药物。
[0003]人表皮生长因子(human epidemal growth factor, EGF)是一种通过受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子，很多恶性肿瘤如肾癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等均过度表达EGF受体。EGF可竞争结合癌细胞表面受体，携带毒素特异地杀伤癌细胞。天花粉蛋白(TrichosantIlin，TCS)是一种自然存在的植物单链毒素，具有抑制肿瘤生长的作用。KDEL则是一段高疏水的序列，将其应用于TCS的末端可以提高TCS的活性，利用EGF的靶向性和TCSKDEL蛋白的细胞毒性构建的EGF — TCSKDEL融合蛋白，能够靶向性杀伤肿瘤细胞，有利于临床肿瘤的治疗。体外实验和移植实体瘤整体动物实验研究表明，该融合蛋白具有明显的靶向抗肿瘤效果。
[0004]家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DHlOBmBac构成，其产生重组病毒的原理是:首先将外源目的基因克隆入供体质粒中，然后将供体质粒转化入DHlOBmBac感受态细胞中，通过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一起转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA，再通过转染家蚕细胞而获得含有目的基因的重组杆状病毒。我们利用该系统快速产生能够表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的重组病毒，并利用家蚕BmN细胞表达出具有活性的EGF — TCSKDEL融合蛋白，为利用家蚕生物反应器生产该融合蛋白打下基础。

【发明内容】

[0005]发明目的:为了解决现有技术所存在的问题，本发明提供了一种具有较高表达量和生物活性的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法。
[0006]技术方案:为达到上述目的，本发明一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF-TCSKDEL融合蛋白的方法，包括以下步骤:
[0007](I)将 EGF — TCSKDEL 基因从质粒 pET28a_EGF — TCSKDEL 中亚克隆至 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒PFastBacHTb的多克隆位点中，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游；
[0008](2)将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DHlOBmBac细胞内，在含有抗生素和半乳糖苷类似物X-Gal的培养板上过夜培养；[0009](3)通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组；
[0010](4)用此DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒；
[0011](5)利用N1- NTA柱从感染重组杆状病毒的家蚕细胞中分离纯化重组EGF—TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞有感染迹象时，收集细胞，将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用N1- NTA柱分离纯化获得相应的目的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白纯度。
[0012]更为优选的，所述步骤(1)中多克隆位点为BamHI和Hindlll。
[0013]更进一步的，所述步骤(2)中抗生素为卡那霉素和庆大霉素中的一种或多种。
[0014]更进一步的,所述卡那霉素的浓度为50 ii g/mL。
[0015]更进一步的，所述庆大霉素的浓度为30 u g/mL。
[0016]更进一步的,所述半乳糖苷类似物X-Gal的浓度为40 U g/mL。
[0017]有益效果:本发明所提供的一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，将EGF — TCSKDEL基因亚克隆至Bac-to-Bac系统的供体质粒PFastBacHTb的多克隆位点中，转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DHlOBmBac细胞内，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，用抽提的质粒DNA转染家蚕细胞BmN，获得含有EGF — TCSKDEL基因的重组杆状病毒，用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，获得大量表达EGF — TCSKDEL融合蛋白；本发明具有较高的表达量和生物活性，为创造新的高活性、高抑瘤率、低免疫原性、小分子量的靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为本发明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb图；
[0019]图2为本发明重组EGF — TCSKDEL融合蛋白经纯化后的SDS-PAGE分析；
[0020]图3为本发明MTT法检测经EGF — TCSKDEL处理的95-D细胞生长情况。
【具体实施方式】
[0021]实施例1:
[0022]材料来源:重组质粒pET28a-EGF — TCSKDEL为本公司保存；DNA marker、限制性内切酶、T4连接酶等均购于Takara ;杆状病毒转移载体pFastBacHTb、Iipofectin和N1-NTA树脂均为Invitrogen公司产品；胎牛血清FCS、家蚕BmN细胞培养基TC-100均为GibcoBRL的产品。
[0023]一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，包括以下步骤:
[0024](I)将 EGF — TCSKDEL 基因从质粒 pET28a_EGF — TCSKDEL 中亚克隆至 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点BamHI和HindIIII之间，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游；
[0025](2)将重组的供体质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DHlOBmBac细胞内，涂布于含卡那霉素50μ g/mL、庆大霉素30 μ g/mL以及半乳糖苷类似物X-Gal40 μ g/mL的培养板上过夜培养；
[0026](3)通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组；
[0027](4)用此DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒；
[0028](5)利用N1- NTA柱从感染重组杆状病毒的家蚕细胞中分离纯化重组EGF—TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞有感染迹象时，收集细胞，将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用N1- NTA柱分离纯化获得相应的目的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白纯度。图2为重组EGF — TCSKDEL融合蛋白经纯化后的SDS-PAGE分析，结果显示，纯化后，重组蛋白经SDS-PAGE显示，纯度超过95%。
[0029]利用MTT法来检测重组EGF—TCSKDEL的抗肿瘤活性的方法:将对数生长期的高转移人肺腺癌细胞95-D (2X105cell/ml)接种于96孔培养板，分别加入不同浓度的EGF—TCSKDEL样品，空白对照组加等体积的培养液，置37 °C，5%C02培养箱中培养24h，吸取含EGF-TCSKDEL血清，每孔加入MTT工作液100 μ L，使EGF — TCSKDEL终浓度为0.5g/L，于细胞培养条件下保温72h ;取出培养板，每孔吸取上清100 μ L，加入100 μ L DMS0，于酶标仪570nm处测吸光度A值，计算细胞存活率:细胞存活率=[实验组A均值一背景组A均值]/[空白组A均值一背景组A均值]X100%，并以EGF — TCSKDEL的不同浓度和细胞存活率作图，确定EGF — TCSKDEL对肿瘤细胞的IC50 ;实验重复3次，图3即为MTT法检测经EGF—TCSKDEL处理的95-D细胞生长情况，显示了重组EGF — TCSKDEL较对照组具有明显的抗肿瘤活性作用。
`[0030]应当指出，以上【具体实施方式】仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
【权利要求】
1.一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将EGF — TCSKDEL 基因从质粒 pET28a-EGF — TCSKDEL 中亚克隆至 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统的供体质粒PFastBacHTb的多克隆位点中，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游；(2)将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DHlOBmBac细胞内，在含有抗生素和半乳糖苷类似物X-Gal的培养板上过夜培养；(3)通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组；(4)用此DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有EGF— TCSKDEL基因的重组杆状病毒；(5)利用N1- NTA柱从感染重组杆状病毒的家蚕细胞中分离纯化重组EGF — TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞有感染迹象时，收集细胞，将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用N1- NTA柱分离纯化获得相应的目的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白纯度。
2.根据权利要求1所述的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述步骤(1)中多克隆位点为BamHI和HindIIK
3.根据权利要求1 所述的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述步骤(2)中抗生素为卡那霉素和庆大霉素中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述卡那霉素的浓度为50 ii g/mL。
5.根据权利要求2所述的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述庆大霉素的浓度为30ii g/mL。
6.根据权利要求1所述的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述半乳糖苷类似物X-Gal的浓度为40 u g/mL。
【文档编号】C12N15/866GK103695468SQ201310407023
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】张俊红, 余永建, 赵顺华, 朱婷 申请人:江苏恒顺醋业股份有限公司