可快速测定滴度的杆状病毒表达载体及其构建和应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域。更具体地说，本发明涉及一种可以快速测定滴度的杆状病毒表达载体及其构建和应用。

背景技术：

杆状病毒表达系统是一个被广泛使用的真核表达系统，它与其他蛋白表达系统相比，具有许多优点，如蛋白质翻译后修饰等等。现在有许多商业化的杆状病毒表达系统，在它们之中，Life公司的Bac-to-Bac系统是最为常用的一个，已成功地表达了数以千计的蛋白。

与传统方法相比，利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒，能减少两周的时间。但根据Bac-to-Bac系统操作手册，测定生产重组杆状病毒滴度也还需要近一个星期。测定病毒滴度是对病毒储存和优化重组蛋白表达一个非常重要的步骤，也是Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒的耗时最长的步骤。目前，许多研究者已经开始使用不同的策略来减少这一步骤的时间。Malde等使用荧光实验芯片与生物分析仪联合检测杆状病毒滴度，从感染到最终检测完成仅需48小时；Shen CF等使用流式细胞仪在24h内，测定了杆状病毒的滴度；Lo等采用荧光定量PCR检测杆状病毒中特定基因的表达量，可在1h内完成对病毒滴度的检测，且结果与终点稀释法相关性良好；另外，Kwon等使用GP64抗体进行染色免疫检测，在24-48小时内测定了杆状病毒的滴度。Yahata等发现重组杆状病毒在昆虫细胞培养扩增期间产生gal量直接与病毒量成比例，通过测定gal的活性推算出了病毒滴度，其测定时间少于24h；等将绿色荧光蛋白克隆到含双启动子(极晚期启动子p10和Ph)的表达转移载体中，与目的蛋白同时表达，然后在显微镜下通过检测绿色荧光蛋白表达间接测定病毒滴度，这种方法也将病毒滴度测定时间缩短到24小时。

然而，这些方法都有其不足之处。前三者需要专门的仪器，相应的检测试剂盒，成本较高，对操作人员也有一定的技术要求。Kwon的方法需要使用价格昂贵的GP64抗体，同时增加洗涤，染色等额外的实验操作。Yahata的方法在病毒液浓度很高时(大于3x10⁵pfu/mL)并不适用。与前者相比，的方法相对更方便经济，但它降低了蛋白的表达能力，因为它占用了表达转移载体上其中一个表达盒的位置。

因此，目前迫切需要在现有的杆状病毒表达系统上，开发出一种可以快速测定滴度的杆状病毒表达载体，并使重组病毒的滴度测定成本更经济、操作更方便。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决测定杆状病毒滴度耗时较长的问题，提供一种更经济、操作更方便且不会影响病毒蛋白表达能力的杆状病毒表达载体。

为了实现以上目的，本发明提供了一种可快速测定滴度的杆状病毒表达载体，在杆状病毒Bacmid bMON14272基因组上非必需基因处插入由杆状病毒极早期启动子ie-1调控的绿色荧光蛋白基因获得所述杆状病毒表达载体，所述杆状病毒表达载体命名为BacG，其生物保藏号为：GDMCC No.60060。

优选的是，所述非必需基因为p74基因。

优选的是，所述增强型绿色荧光蛋白基因为增强绿色荧光蛋白基因egfp。

一种可快速测定滴度的杆状病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1：获取杆状病毒p74基因的下游片段L、ie-1启动子基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、杆状病毒p74基因上游片段R，并将该四种基因片段依次连接到载体pFastBac1上，构建重组质粒pFB-LECR；

S2：将pFB-LECR重组质粒双酶切后胶回收并纯化得到LECR线性片段，然后将LECR线性片段电转进内含表达同源重组酶的质粒pBAD-gbaA的大肠杆菌DH10B感受态细胞中，通过同源重组，在Bacmid bMON14272的p74基因处插入ie-1启动子调控的增强型绿色荧光蛋白基因及氯霉素抗性基因，再涂板通过抗性筛选获得含成功重组的杆状病毒表达载体的单克隆细菌；

S3：再通过抗性筛选S2中获得的单克隆细菌，获得丢失pBAD-gbaA质粒的杆状病毒表达载体细菌；

S4：将S3中获得的杆状病毒表达载体转染到昆虫细胞里，获得重组杆状病毒。

优选的是，步骤S3中抗性筛选方法为将重组成功的含有杆状病毒表达载体的单克隆细菌在不含氨苄抗生素的培养基中培养。

优选的是，ie-1启动子基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合片段E是经由引物从野生型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒ACMNPV基因组的Bacmid上扩增得到的ie-1启动子基因片段与由引物从质粒pEGFP-C2上扩增得到的增强型荧光蛋白基因片段融合获得。

优选的是，氯霉素抗性基因片段C是由引物从质粒pLysS中扩增获得。

本发明还提供一种上述可快速测定滴度的杆状病毒表达载体在快速测定杆状病毒滴度中的应用。

一种快速测定杆状病毒滴度的方法，包括如下步骤：

(1)取对数生长期的昆虫细胞悬浊液铺于细胞培养板上，再置于培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；

(2)将所述杆状病毒表达载体生产的重组杆状病毒梯度稀释后接种到昆虫细胞培养板中，再于培养箱中培养8-24h，在荧光显微镜下观察细胞，出现荧光反应孔即可直接判定细胞已被杆状病毒感染；

(3)采用终点稀释法计算重组杆状病毒的TCID₅₀。

优选的是，上述TCID₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明的杆状病毒表达载体生产的重组杆状病毒依赖增强型绿色荧光蛋白荧光信号表达测定病毒滴度，相比利用终点稀释法定量病毒滴度较传统方法(比如空斑测定)更为直观、准确；

(2)本发明的杆状病毒表达载体生产的重组杆状病毒依赖由极早期启动子ie-1调控的增强型绿色荧光蛋白荧光信号表达的终点稀释法定量病毒滴度时，8-24h小时内即可在荧光显微镜下观察到病毒的感染情况，相比较其他检测方法的周期(一般为6-8天)，缩短了检测周期，使得终点稀释法测定病毒滴度更加快捷；

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的杆状病毒载体表达载体BacG结构示意图，其中Kan表示Bacmid本身具有卡那霉素抗性。

图2为本发明测定的杆状病毒滴度的操作流程图；

图3为显微镜下观察应用本发明生产的杆状病载体毒感染细胞的结果图，A：可见光、100倍放大；B：488nm激发光、100倍放大。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

一种可快速测定滴度的杆状病毒表达载体，在杆状病毒基因组Bacmid上非必需基因处插入由杆状病毒极早期启动子ie-1调控的绿色荧光蛋白基因获得所述杆状病毒表达载体。所述杆状病毒表达载体以质粒形式存在于大肠杆菌中，所述杆状病毒表达载体命名为BacG，分类命名为Escherichia coli，于2016年8月9日在位于广东省广州市先烈中路100号大院的广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为：GDMCC No.60060。

其中，所述非必需基因为p74基因。

其中，所述绿色荧光蛋白基因为增强绿色荧光蛋白基因egfp。

一种可快速测定滴度的杆状病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1：获取杆状病毒p74基因的下游片段L、ie-1启动子基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、杆状病毒p74基因上游片段R，并将该四种基因片段依次连接到载体pFastBac1上，构建重组质粒pFB-LECR；

S2：将pFB-LECR重组质粒双酶切后胶回收并纯化得到LECR线性片段，然后将LECR线性片段电转进内含表达同源重组酶的质粒pBAD-gbaA的大肠杆菌DH10B感受态细胞中，通过同源重组，在Bacmid bMON14272的p74基因处插入ie-1启动子调控的增强型绿色荧光蛋白基因及氯霉素抗性基因，再涂板通过抗性筛选获得含成功重组的杆状病毒表达载体的单克隆细菌；

S3：再通过抗性筛选S2中获得的单克隆细菌，获得丢失pBAD-gbaA质粒的杆状病毒表达载体细菌；

S4：将S3中获得的杆状病毒表达载体转染到昆虫细胞里，获得重组杆状病毒。

其中，步骤S3中抗性筛选方法为将重组成功的含有杆状病毒表达载体的单克隆细菌在不含氨苄抗生素的培养基中培养。

其中，ie-1启动子基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合片段E是经由引物从野生型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒ACMNPV基因组的Bacmid上扩增得到的ie-1启动子基因片段与由引物从质粒pEGFP-C2上扩增得到的增强型荧光蛋白基因片段融合获得。

其中，氯霉素抗性基因片段C是由引物从质粒pLysS中扩增获得。

本发明还提供一种上述可以快速测定滴度的杆状病毒表达载体在快速测定杆状病毒滴度中的应用。

一种快速测定杆状病毒滴度的方法，包括如下步骤：

1)取对数生长期的昆虫细胞悬浊液铺于细胞培养板上，再置于培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；

2)将所述重组杆状病毒梯度稀释后接种到昆虫细胞培养板中，再于培养箱中培养8-24h，在荧光显微镜下观察细胞，出现荧光反应孔即可直接判定细胞已被杆状病毒感染；

3)采用终点稀释法计算重组杆状病毒的TCID50。

其中，上述TCID50的计算方法采用Reed-Muench法。

下面结合实施例具体说明：

实施例1

材料Sf9细胞为一种常用的昆虫细胞，购自invitrogen公司；SF900Ⅱ无血清培养基为Gibco公司产品；含供体质粒pFastBac1的Bac-to-Bac系统购自Invitrogen Life Science公司；大肠杆菌菌株(DH5α)有由实验室保存；大肠杆菌菌株DH10Bac(含亲本Bacmid bMON14272和辅助质粒pMON7124)购自Invitrogen Life Science公司；含有bMON14272质粒和pBAD-gbaA质粒的DH10B菌株(DH10B-pAcWt-gbaA菌株)由中山大学惠赠。plysS质粒(含氯霉素抗性基因)、pEGFP-C2质粒(含增强型绿色荧光蛋白基因)由发明人实验室保存。

1)杆状病毒表达载体的构建，见图1

构建带有增强型绿色荧光蛋白的重组线性片段，包括：杆状病毒质粒p74基因的下游片段L、ie-1启动子基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、杆状病毒质粒p74基因上游片段R，将该四种基因片段依次连接到载体pFastBac1上构建重组质粒pFB-LECR。该重组线性片段在细胞中翻译表达顺序如图1中箭头所示，其中上游同源序列和下游同源序列的位置固定。

下游同源序列L为苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV的118，729–119，269nt序列，下游同源序列L由引物p74L1、p74L2从含有野生型ACMNPV基因组的Bacmid上扩增得到；

上游同源序列R为AcMNNPV的121，073–121，660nt序列，片段R分别由引物p74R1、p74R2从含有野生型ACMNPV基因组的Bacmid上扩增得到；

ie-1启动子序列为AcMNPV的126，623–127，197nt序列，ie-1启动子与增强型绿色荧光蛋白融合片段E，经由引物ie1F和ie1R从含有野生型ACMNPV的Bacmid上扩增得到的ie-1启动子基因片段和由引物EGFP-F和EGFP-R从pEGFP-C2上扩增得到的增强型绿色荧光蛋白基因egfp片段融合获得；

氯霉素的抗性筛选基因C由引物Cm-F和Cm-R从质粒pLysS中扩增得到。

各对引物由上海立菲生物技术有限公司合成，具体如表1所示：

表1

注：下划线标记序列为酶切位点序列

将上述重组质粒pFB-LECR酶切获得完整的重组线性片段LECR，将重组线性片段LECR电转进大肠杆菌DH10B(DH10B-pAcWt-gbaA，含有亲本Bacmid bMON14272和编码重组酶的质粒pBAD-gbaA)的感受态细胞中，通过涂板经抗性筛选获得重组成功的含有杆状病毒表达载体的单克隆细菌。

再次抗性筛选重组成功的含有杆状病毒表达载体的单克隆细菌，获得不含pBAD-gbaA质粒的杆状病毒表达载体细菌，该抗性筛选方法为将重组成功的含有杆状病毒表达载体的单克隆细菌在不含氨苄抗生素的培养基中筛选，使pBAD-gbaA质粒失去抗性压力丢失，从而获得不含pBAD-gbaA质粒的杆状病毒表达载体的细菌；

将上述步骤获得的杆状病毒表达载体细菌的基因组Bacmid转染进sf9细胞系，获得重组后的杆状病毒。

2)应用实例，见图2

细胞板的制备：Sf9细胞以SF900Ⅱ无血清培养基在摇瓶中进行悬浮培养，摇床转速100rpm，培养温度27℃。处于对数生长期的、悬浮培养中的Sf9细胞，以SF900Ⅱ无血清培养基稀释，稀释后的细胞液以2×10⁴/mL的昆虫细胞悬液铺入96孔细胞培养板中，100μl/孔，置27℃培养箱中静置培养，使Sf9细胞贴于孔底，备用。

将重组杆状病毒梯度稀释后，取10^-1～10^-6共6个稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，每个稀释度接种8个重复，细胞培养板置于27℃恒温条件下培养8-24h，在荧光显微镜下观察细胞，出现荧光反应孔即可直接判定细胞已被杆状病毒感染。

采用终点稀释法计算重组杆状病毒的TCID₅₀。

结果：倒置荧光显微镜下观察操作后的Sf9细胞，感染重组杆状病毒的细胞膜有亮绿色荧光，没有感染重组杆状病毒的阴性细胞无任何荧光信号，容易区分感染细胞和非感染细胞孔。图3(A)与图3(B)为同一视野，不同光下的情况。其中，图3(B)为488nm激发光下，感染细胞和非感染细胞清晰可辨，而在图3(A)的可见光下，感染细胞和非感染细胞很难区分。所以倒置荧光显微镜下观察经IFA操作的测定方法，感染和非感染细胞的辨识度更高，检测结果更为可信。根据Reed-Muench两氏法计算

距离比例(PD)＝(高于50％感染率的百分数-50％)/(高于50％感染率的百分数-低于50％感染的百分数)

LogTCID50＝高于50％感染率的稀释度的对数-距离比例

TCID50＝高于50％感染率的稀释度+距离比例

根据公式计算，测得病毒滴度，TCID₅₀＝10^4.42

原病毒滴度为10^4.42/100μl＝10^7.42/ml

实施例2：

1、构建含CD4基因的重组杆状病毒：使用本专利构建的杆状病毒表达载体代替原invitrogen公司Bac to Bac系统亲本Bacmid bMON14272，其余构建步骤同Bac to Bac操作手册。

2、细胞板的制备：Sf9细胞以SF900Ⅱ无血清培养基在摇瓶中进行悬浮培养，摇床转速100rpm，培养温度27℃。处于对数生长期的、悬浮培养中的Sf9细胞，以SF900Ⅱ无血清培养基稀释，稀释后的细胞液以2×10⁴/mL的昆虫细胞悬液铺入96孔细胞培养板中，100μl/孔，置27℃培养箱中静置培养，使Sf9细胞贴于孔底，备用。

3、将重组杆状病毒梯度稀释后，取10^-1～10^-6共6个稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，每个稀释度接种8个重复，细胞培养板置于27℃恒温条件下培养8-24h，在荧光显微镜下观察细胞，出现荧光反应孔即可直接判定细胞已被杆状病毒感染。采用终点稀释法计算重组杆状病毒的滴度。

4、病毒滴度计算：显微镜下观察步骤3)记录细胞板上发荧光情况，采用终点稀释法用Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

测得TCID₅₀＝10^4.68

原病毒滴度为10^4.68/100μl＝10^7.68/ml

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。