专利名称：稳定转化家蚕细胞株滴定BmNPV法及报告基因构建法的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术中利用基因工程方法构建稳定转化细胞株并测定病毒滴度的技术领域。
背景技术：
昆虫杆状病毒载体表达系统表达的蛋白质产物具有类似于哺乳动物细胞一样的翻译后修饰和加工作用，因而该表达系统得到普遍应用。然而，利用杆状病毒能否高效稳定地表达目的蛋白与接种的病毒滴度有很大关系。传统的方法是利用空斑法测定病毒滴度。后来，又相继发展出终点稀释法测定病毒滴度和基于特异抗体的滴度测定法。这些方法通常要求操作者具有相当程度的专业知识和熟练的细胞培养操作技术，并且需要通过显微镜观察空斑或者细胞病变情况；或者，购买昂贵的特异抗体检测试剂盒。以BmNPV病毒为载体的家蚕杆状病毒表达系统不仅可以家蚕培养细胞作为宿主，而且还可以家蚕幼虫和蛹作为生物反应器大量表达目的蛋白，即家蚕生物反应器。相对于AcMNPV病毒细胞培养系统而言,家蚕生物反应器因家蚕幼虫易于饲养、技术成熟、成本低和可规模化而更有产业化的前景。但目前家蚕BmNPV病毒仍然主要采用经典的空斑法或者终点稀释法测定滴度，尚未有改良的快速测定方法。通常采用这两种方法滴定病毒时，通过相差显微镜肉眼观察病毒感染细胞形成的空斑或者病变效应来判断病毒的感染情况，从接种病毒到观察到明显的空斑或者细胞病变现象约需6-7天，因而比较耗时。另外，肉眼通过相差显微镜观察细胞的空斑或者病变效应时，需要仔细观察细胞的形态变化来判断细胞是否被感染。尤其是对于无多角体的低滴度重组病毒来说，产生的细胞病变效应不易判断。故，这种观察比较费力，且不易。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用多角体基因启动子驱动报告基因稳定转化的家蚕细胞株作为宿主测定BmNPV滴度。这种方法便于肉眼通过普通荧光显微镜直接观察，无需借助昂贵的特定仪器，可在接种病毒后3 4天内测定病毒滴度，从而实现BmNPV病毒滴度的快速测定。为了解决上述技术问题，本发明提供一种报告基因转化载体的构建方法，包括如下步骤:1)、构建报告基因转移载体；2)、PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒；以报告基因转移载体为模板，扩增上游为多角体启动子(Polyhedrin Promoter,Ppolh)下游为多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的报告基因表达盒；3)、获得报告基因转化载体:通过双酶切转化载体pIZT/V5-His制备0pIE2启动子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)两个元件之外的转化载体；在丁4DNA连接酶的作用下，将步骤2)所得的报告基因表达盒PCR产物经同样双酶切后连接到所述转化载体中，筛选鉴定克隆有报告基因表达盒的重组转化载体。作为本发明的报告基因转化载体的构建方法的改进:报告基因为红色荧光蛋白基因(DsRed)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。作为本发明的报告基因转化载体的构建方法的进一步改进:步骤I)为:将报告基因的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至同样经BamHI和EcoRI双酶切的pBacPAK8转移载体上，所得的重组质粒为报告基因转移载体。本发明还同时提供了一种报告基因稳定转化家蚕细胞的筛选方法，包括如下步骤:I)、将作为报告基因转化载体的重组质粒转染家蚕BmN细胞；2)、稳定转化细胞株的筛选:按照培养基中博来霉素(Zeocin)终浓度为300 μ g/mL的条件进行培养筛选，符合稳定发出绿色荧光条件的为报告基因稳定转化的家蚕细胞，简称家蚕稳转细胞；最终筛选获得比例达99%的家蚕稳转细胞即为该报告基因的稳定转化细胞系。本发明还同时提供了一种利用报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法，包括如下步骤:I)、细胞培养:将家蚕稳转细胞进行培养；2)、病毒样品的制备:将待测BmNPV样品进行10倍系列的梯度稀释；3)、病毒接种:在步骤I)所得的家蚕稳转细胞中加入步骤2)所得的梯度稀释后的病毒样品进行培养，每个稀释度设置若干个重复；4)、统计细胞感染率:根据步骤3)所得的病毒接种后家蚕稳转细胞被BmNPV感染的情况；统计每个稀释度的阳性孔数和阴性孔数；5)、计算病毒滴度:根据各稀释度的阳性孔数和阴性孔数，按Reed-Muench法计算该病毒的TCID5tl值。具体而言，本发明首先构建报告基因转移载体，以此载体为模板，扩增上游为多角体启动子(Polyhedrin Promoter, Pptjlh)下游为多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的报告基因表达盒；再通过双酶切转化载体pIZT/V5-His制备0pIE2启动子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)两个元件之外的载体大片段；在T4 DNA连接酶的作用下，将报告基因表达盒连接到转化载体中，筛选鉴定克隆有报告基因表达盒的重组转化载体。本发明还提供了 报告基因稳定转化家蚕细胞株的筛选方法。本发明还提供了报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法。本发明的技术原理是利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动报告基因表达来指示病毒的感染。杆状病毒基因的表达是一种级联调控模式，即早期基因先表达，然后晚期基因表达，最后极晚期基因表达，先表达的基因调控后表达的基因。通常，极晚期基因的表达可以表明病毒复制周期的完成。故，极晚期基因启动子驱动的报告基因表达可以指示病毒的感染。对于基因组整合有极晚期基因启动子驱动的报告基因表达盒的细胞来说，一旦受到病毒的感染就会表达报告基因，通过检测报告基因的表达产物就可以知道细胞受到病毒感染。本发明的技术优势在于红色荧光易于观察，且耗时短。综上所述，本发明涉及一种报告基因稳定转化家蚕细胞株的筛选和滴定BmNPV方法。本发明构建了一种报告基因转化载体，转染家蚕细胞，经筛选获得报告基因稳定转化的家蚕细胞株。所述细胞 株可应用于滴定BmNPV。本发明所述的滴定方法能快速测定BmNPV病毒滴度，成本低，操作方便，测定结果准确。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为DsRed红色荧光蛋白基因的克隆图；Ml:DL2000,1 =DsRed 的 PCR 产物。图2为重组转移载体pBacPAK8_DsRed的构建图；Ml:DL2000,1 =DsRed 的 PCR 产物，2:pBacPAK8_DsRed 质粒 BamHI 和 EcoRI 双酶切产物，M2:DL15000o图3为Ppolh-DsRed-PolyA表达盒的合成图；Ml:DL2, 000 ； I =Ppolh-DsRed-PolyA 的 PCR 产物。图4为pIZT-DsRed的构建图；M3:GeneRuler DNA Ladder Mix ；I: pIZT-DsRed PCR产物；2: pIZT-DsRed PstI酶切产物;3: pIZT-DsRed BamHI酶切产物。图5是稳定转化家蚕细胞株BmN-RFP的筛选图；A:pIZT_DsRed 转染 BmN48 小时后；B:Zeocin 筛选 I 个月后；C:Zeocin 筛选 3 个月后。
具体实施例方式实施例1.红色荧光蛋白(DsRed)转移载体pBacPAK8_DsRed的构建本发明中报告基因仅以红色荧光蛋白基因(DsRed)为例，但不限于此，可以是其他的报告基因，如LacZ等等。(I) PCR克隆红色荧光蛋白基因(DsRed)根据红色突光蛋白基因(DsRed)完整的ORF序列(Clontech公司pDsRed-Monomer载体)设计正向引物(Fl:5’-ACGGGATCCATGGACAACACCGAGGA-3’)和反向引物(Rl:5’-GGGAATTCCTACTGGGAGCCGGAGTG-3’ )。以pDsRed-Monomer (Clontech公司)载体质粒为模板，扩增目的片段。PCR反应体系如下:
权利要求
1.报告基因转化载体的构建方法，其特征是包括如下步骤: 1)、构建报告基因转移载体； 2)、PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒； 以报告基因转移载体为模板，扩增上游为多角体启动子(Polyhedrin Promoter, Ppolh)下游为多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的报告基因表达盒； 3)、获得报告基因转化载体: 通过双酶切转化载体pIZT/V5-His制备0pIE2启动子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)两个元件之外的转化载体；在T4DNA连接酶的作用下，将步骤2)所得的报告基因表达盒PCR产物经同样双酶切后连接到所述转化载体中，筛选鉴定克隆有报告基因表达盒的重组转化载体。
2.根据权利要求1所述的报告基因转化载体的构建方法，其特征是: 所述报告基因为红色荧光蛋白基因(DsRed)、β -半乳糖苷酶基因(LacZ)。
3.根据权利要求1或2所述的报告基因转化载体的构建方法，其特征是: 所述步骤I)为: 将报告基因的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至同样经BamHI和EcoRI双酶切的pBacPAK8转移载体上，所得的重组质粒为报告基因转移载体。
4.报告基因稳定转化家蚕细胞的筛选方法，其特征是包括如下步骤: 1)、将作为报告基因转化载体的重组质粒转染家蚕BmN细胞； 2)、稳定转化细胞株的筛选: 按照培养基中博来霉素(Zeocin)终浓度为300 μ g/mL的条件进行培养筛选,符合稳定发出绿色荧光条件的为报告基因稳定转化的家蚕细胞，简称家蚕稳转细胞；最终筛选获得比例达99%的家蚕稳转细胞即为该报告基因的稳定转化细胞系。
5.利用报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法，其特征是包括如下步骤: 1)、细胞培养: 将家蚕稳转细胞进行培养； 2)、病毒样品的制备: 将待测BmNPV样品进行10倍系列的梯度稀释； 3)、病毒接种: 在步骤I)所得的家蚕稳转细胞中加入步骤2)所得的梯度稀释后的病毒样品进行培养，每个稀释度设置若干个重复； 4)、统计细胞感染率: 根据步骤3)所得的病毒接种后家蚕稳转细胞被BmNPV感染的情况；统计每个稀释度的阳性孔数和阴性孔数； 5)、计算病毒滴度: 根据各稀释度的阳性孔数和阴性孔数，按Reed-Muench法计算该病毒的TCID5tl值。
全文摘要
本发明公开了一种报告基因转化载体的构建方法，包括构建报告基因转移载体；PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒；获得报告基因转化载体。本发明还同时公开了一种利用报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法，包括如下步骤1)细胞培养；2)病毒样品的制备；3)病毒接种在步骤1)所得的家蚕稳转细胞中加入步骤2)所得的梯度稀释后的病毒样品进行培养；4)统计细胞感染率；5)计算病毒滴度。本发明的方法便于肉眼通过普通荧光显微镜直接观察，无需借助昂贵的特定仪器，可在接种病毒后3~4天内测定病毒滴度，从而实现BmNPV病毒滴度的快速测定。
文档编号C12Q1/02GK103114101SQ20131007084
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者陈健, 陈琴, 陈和, 于威, 张耀洲 申请人:浙江理工大学