抗逆相关sos3类似钙离子结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：抗逆相关sos3类似钙离子结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗逆相关S0S3类似钙离子结合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
土壤盐溃化、干旱等逆境是植物生长、发育的主要环境限制因素。植物为了应对逆境，在长期进化过程中演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生理水平上响应的精细调控机制(Li Ruifen, Zhang Junwen, Wei Jianhua, Ma Rongcai, 2009.Functions and Mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant responseto abiotic stresses.Progress in Natural Science，19 (6):667_676)。Ca2+依赖的信号途径在植物多种生物过程包括逆境胁迫响应中发挥重要作用(Kudla J., Batistic0.&Hashimoto K.,2010.Calcium signals:the lead currency of plant informationprocessing.The Plant Cell，22:541_563)。在解密Ca2+信号、应答植物逆境胁迫的过程中钙离子感受器是重要的信号传递者，调控胁迫响应基因的开与关(Luan S.，KudlaJ.，Rodriguez-Concepcion M.，Yalovsky S.，Gruissem W.，2002.Calmodulins andcalcineurin B-1 ike proteins: calcium sensors for specific signal responsecoupling in plants.The Plant Cell，14，389-400)。根据功能和结构的不同，I丐离子感受器分为响应型和依赖性钙离子感受器。前者既能结合Ca2+，又具有激酶活性，如钙离子依赖性蛋白激酶(CDPKs);而后者只能结合Ca2+，并与特异的蛋白激酶互作后才能传递钙信号，如S0S3 类似钙离子结合蛋白(S0S3-LIKE CALCIUM BINDING PROTEIN,简称 SCaBP)。SCaBP型钙感受器是一类仅存在于植物中与动物钙调磷酸酶B亚基(calcineurinB, CNB)及中枢神经I丐感受器(neuronal calcium sensors, NCS)极其相似的小分子蛋白，因此被命名为calcineurin B-1ike蛋白，即CBL或CBL钙感受器。由于SOS途径发现较早，人们也将该感受 器称作SCaBPs (Liu J, Zhu JK, 1998.A calcium sensorhomolog required for plant salt tolerance.Science, 280:1943-1945;Kudla J, XuQ, Harfter K,Gruissem ff, and Luan S,1999.Genes for calcineurin B-1ike proteinsin Arabidopsis are differentially regulated by stress signals.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.,96:4718-4723)。目前在拟南芥和水稻中均鉴定出10个SCaBPs,分别与26个AtCIPKs、30个OsCIPKs组成互作复合体，调控下游基因的表达。迄今，已鉴定出一些SCaBPs参与逆境胁迫应答的调控。如SCaBP5/CBLl和SCaBP7/CBL9参与低K+胁迫的调控(Xu J, Li H-D, Chen L-Q, Wang Y，Liu L-L, He L, and Wu ff-H, 2006.A proteinkinase, interacting with two calcineurin B-1ike proteins regulates K+transporterAKTlin Arabidopsis.Celll25:1347-1360 ；Li L1Kim B-G, Cheong Y H, Pandey G K, andLuan S, 2006.A Ca2+signaling pathway regulates a K channel for low-K+response inArabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA, 103(33):12625-12630) ;S0S3/CBL4 和 SCaBP8/CBLlO则参与SOS调控途径，在SOS途径中二者分别与AtCIPK24/S0S2互作调控植物根和地上部的耐盐性(Qiu Q-S, Guo Y, Dietrich M, Schumaker KS, Zhu J-K, 2002.Regulation ofSOSI, a plasma membrane NaVH+ exchanger in Arabidopsis thaliana, by S0S2and S0S3.Proc Natl Acad Sci USA, 99:8436-8441 ；uan RD, Lin HX, Mendoz I,Zhang YG, Cao WH, YangYQ, Shang M, Chen SY, Pardo JM, and Guo Y, 2007.SCABP8/CBL10,a Putative CalciumSensor, Interacts with the Protein Kinase S0S2to Protect Arabidopsis Shoots fromSalt Stress.Plant Cell, 19:1415-1431) ；AtSCaBP4/CBL5 参与干旱胁迫的响应，但还不清楚具体的调控途径(Cheong YH, Sung SJ, Kim B-G, Pandey GK, Cho J-S, Kim K-N&LuanS，2010.Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5confers osmotic ordrought stress tolerance in Arabidopsis.Molecules and Cells29, 159-165)。部分SCaBPs还参与植物生长发育的调控。可见，SCaBP作为钙离子感受器具有多样化的生物学功能。近年来已开展了部分作物SCaBP/CBL-CIPK功能研究(Mahajan S, Sopory S K, TutejaN，2006.Cloning and characterization of CBL-CIPK signalling components from alegume (Pisum sativum).FEBS Journal, 273 (5): 907-925),并取得了一定进展。由于不同物种同源SCaBP基因可能具有不同功能或新功能，克隆应答各种逆境胁迫的SCaBP基因，有可能解析某种抗逆调控途径。但目前研究的材料大部分局限于模式植物或甜土植物，非特殊种质。一些特殊生境种质材料可能具有解密逆境Ca2+信号的特殊途径，挖掘克隆特殊生境植物信号组分基因，对有效利用基因资源改良作物抗逆性具有重要意义。野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，可在含盐量0.6-1.0%的土地上良好生长，它的耐盐性可与小花碱茅等媲美，具有重要的应用和科学研究价值。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，在抗逆调控基因的克隆与功能分析方面研究较少。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗逆相关S0S3类似钙离子结合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的应用，具体为如下A或B:A:由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质(命名为HbSCaBP)在如下al)或a2)中的应用:al)调控植物抗盐性；a2)选育抗盐植物品种。B:由序列表中序列I所不的氣基酸序列组成的蛋白质的编码基因(命名为HbSCaBP)在如下al)或a2)中的应用:al)调控植物抗盐性；a2)选育抗盐植物品种。本发明还提供一种培育耐盐转基因植物的方法。本发明所提供的培育耐盐转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:a)向目的植物中导入由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比耐盐性提高的转基因植物。在上述应用或方法中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即HbSCaBP基因)是如下I)至4)中任一所述的DNA分子:I)编码序列为序列表中序列2自5’末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。在上述方法中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因具体是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型品种Columbia或拟南芥突变体sos3。本发明所提供的蛋白质，为S0S3类似钙离子结合蛋白，名称为HbSCaBP，来源于野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.) Link),是如下 a)或 b):a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列I衍生的蛋白质；序列表中序列I由218个氨基酸残基组成。为了便于HbSCaBP蛋白的纯化，可在由序列表中序列I的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表:标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为 5 个)RRRRR
Poly-His2-10 (通常为 6 个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myclOEQKLISEEDL上述a)中的HbSCaBP蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的HbSCaBP蛋白可通过如下方法得到:将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上上表所示的标签的编码序列得到编码基因，再进行生物表达得到HbSCaBP蛋白。编码所述HbSCaBP蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述HbSCaBP (野大麦S0S3类似钙离子结合蛋白)蛋白的基因(命名为HbSCaBP);所述HbSCaBP基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子:I)编码序列为序列表中序列2自5’末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述HbSCaBP蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HbSCaBP蛋白的DNA分子；上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65oC下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 1XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列2由1159个核苷酸组成，第85至741位为其编码序列，编码序列表中序列I所不的蛋白质。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述HbSCaBP基因转录的启动子具体为花椰菜花叶病毒35s启动子(CaMV35S启动子)。更为具体的，所述重组表达载体为将所述HbSCaBP基因(序列2的第85至741位)插入到pGreen0029载体的多克隆位点BamH I和EcoR I之间后得到的重组质粒。所述表达盒由能够启动所述HbSCaBP基因表达的启动子，所述HbSCaBP基因，以及转录终止序列组成。所述重组载体、所述表达盒、所述转基因细胞系或所述重组菌在如下al)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围:a I)调控植物抗盐性；a2)选育抗盐植物品种；在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型品种Columbia或拟南芥突变体sos3。在本发明中，以上所有al)中的所述调控植物抗盐性均具体为提高植物抗盐性；以上所有a2)中的所述选育抗盐植物品种的方法，均具体可包括将所述HbSCaBP蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。本发明从特殊种质-盐生野大麦中克隆鉴定出一个强烈响应盐胁迫的HbSCaBP基因。该基因编码一个参与逆境信号传递的S0S3类似钙离子结合蛋白，其主要定位于细胞质膜上。实验证明，HbSCaBP基因在拟南芥突变体sos3过表后可抑制其敏盐表型，在拟南芥野生型Columbia过表达可提高植株的耐盐性。可见，HbSCaBP蛋白是耐盐调控系统中一个重要的调控因子。


图1为HbSCaBP与拟南芥、水稻和高粱SCaBP家族的系统进化树分析。图2为HbSCaBP基因在不同生物胁迫下的表达分析。其中，a为野大麦根和茎分别在350mM NaCl、350mM甘露醇和10%PEG6000下胁迫6h，4°C冷胁迫12h，及对照(CK，未经处理的野大麦根和茎)条件下的HbSCaBP基因的表达情况；b为野大麦根和茎分别在350mMNaCl、350mM 甘露醇、10%PEG6000 和 150 u M ABA 胁迫 24h, 4°C冷胁迫 48h，及对照(CK，未经处理的野大麦根和茎)条件下HbSCaBP基因的表达情况。图3为转HbSCaBP基因拟南芥的PCR检测结果。其中，a为T2代转入重组表达载体pGreen0029-HbSCaBP的拟南芥突变体sos3的鉴定结果，s1、s3、s5、s9、sl5和sl7表示6个不同的转基因株系；b为T3代转入重组表达载体pGreen0029-HbSCaBP的拟南芥野生型Columbia的鉴定结果，w3、w4、s5、wll、wl6和wl8表不6个不同的转基因株系。a和b中，“质粒”为以重组表达载体pGreen0029-HbSCaBP作为模板的对照；“空载体”为以载体pGreen0029作为模板的对照；泳道M均为DNA分子量标准。图4为T2代转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3的纯合株系(s5、s9和sl7)的发芽试验和幼苗生长试验的结果。其中，a为转基因株系(s5、s9和sl7)及拟南芥突变体sos3在含NaCl不同浓度(O、100、125`和150mM)培养基上的发芽率的统计结果；b为转基因株系(s5、s9和sl7)及拟南芥突变体sos3在含NaCl不同浓度(O、100、125和150mM)培养基上胁迫生长2周后的平均单株鲜重的统计结果；c为转基因株系(s5、s9和sl7)、拟南芥突变体sos3及未转基因的拟南芥野生型Columbia(WT)在含NaCl不同浓度(O、100、125和150mM)培养基上胁迫生长2周后的生长表型照片。
图5为T3R转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia的纯合株系(W5、W11和W16)的发芽试验和幼苗生长试验的结果。其中，a为转基因株系(W5、W11和W16)及未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同浓度(O、100、125和150mM)培养基上的发芽率的统计结果；b为转基因株系(W5、Wll和W16)及未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同浓度(O、100、125和150mM)培养基上胁迫生长2周后平均单株鲜重的统计结果；c为转基因株系(W5、W11和W16)及未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同浓度(O、100、125和150mM)培养基上胁迫生长2周后的生长表型照片。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。拟南芥野生型Columbia 和拟南芥突变体 sos3:http://www.arabidopsis.0rg 网站。其中，拟南芥突变体sos3的编号为CS3864，突变体表型为叶片表面光滑，无或少表皮毛，敏盐性详细描述见“Liu J P&Zhu J K J, 1997.An Arabidopsis mutant that requiresincreased calcium fo r potassium nutrition and salt tolerance.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,94:14960-14964”。pGreen0029 载体:在网上 http://www.pgreen.ac.uk/ 订购。农杆菌Gv3101 (含助手载体pSoup):购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab。MS平板:含4.3g/L MS粉末，20g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH5.8。各浓度为终浓度。其中MS粉末为Sigma公司产品，其产品目录号为M5519。实施例1、与植物耐盐性相关的基因HbSCaBP的获得及鉴定一、与植物耐盐性相关的基因HbSCaBP的获得1、野大麦材料培养盐生牧草-野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.) Link),采自内蒙古盐溃化草原。在室温条件下，将野大麦种子用去离子水浸泡12h后，放入到4°C冰箱中过夜。用灭菌的去离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25°C萌芽。经过4 5天待其大部分发芽之后，转到灭菌的盛有l/2Hoagland培养液的玻璃瓶中(用不透光的纸包住)，在温度22-23°C，光照强度1000-3000ii mol JiT2S'光照12h/天、黑暗12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时，在l/2Hoagland培养液中加入终浓度为430mmo/L的NaCl进行胁迫，胁迫30min后备用。其中，Hoaglan培养液配方:0.51g/L KN03、0.82g/L Ca (NO3) 2、0.49g/LMgSO4 7H20、0.136g/L KH2PO4 ;再加入 ImL Fe EDTA 溶液(配制方法:分别溶解 7.45gNa2EDTA,5.57g FeSO4 7H20于200mL蒸馏水中，加热。不断搅拌Na2EDTA溶液与FeSO4溶液混合，定容至 1L);然后加入 ImL A-Z 溶液(配方:2.80mg/L H3BO3,0.08mg/LCuS04 5H20，0.22mg/L ZnSO4 7H20，81mg/L MgCl2 6H20，0.09mg/L HMoO 4H20)。以上各浓度均为相应组分在相应溶液中的终浓度。l/2Hoagland培养液为将上述Hoaglan培养液中各组分的浓度减半后所得的溶液。2、HbSCaBP 基因克隆
(1)5’端序列的获得
以步骤I中在430mmo/L NaCl胁迫下处理30min的野大麦幼苗的根为实验材料，同时以未处理的野大麦幼苗的根为对照材料。将实验材料和对照材料分别用铝薄纸包好标明，立即投入液氮中固定，-80°C保存备用。根据Trizol (Invitrogen, USA)试剂盒说明，提取经盐处理野大麦根及对照材料的总RNA，DNase I消化总RNA中残留的DNA，酚/氯仿/异戊醇混合液(体积比25:24:1)抽提总RNA，分光光度计测定OD26tl和OD28tl,根据OD26tl值计算 RNA 的产量；根据 OD260/OD280 值判断 RNA 的质量。按照 Superscript III (Invitrogen)试剂盒说明，取200ng总RNA反转录为cDNA。根据文献(Rivandi J., Miyazaki J., HrmovaM.，Pallotta M., Tester M.&Collins N.C., 2011.AS0S3homologue maps to HvNax4, abarley locus controlling an environmentally sensitive Na+exclusion trait.Journal of Experimental Botany, 62:1201-1216)中报导的大麦基因 HvNax4 (Genbank:HM175878)设计同源引物Hb-Fl和Hb-Rl，以上述所得cDNA为模板进行PCR扩增。PCR程序:94°C预变性 2min ;94°C变性 30s，63°C退火 30s，72。。延伸 lmin,30 个循环；72°C延伸 7min，10°C保存。将PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)，单克隆在于北京博迈德生物技术公司测序。所获得的5’端序列通过在线NCBI blast分析确认序列的正确性。Hb-Fl:5，-GTAGAGTGCGGAGCTTATTCTCTCGCC-3’ (Genbank:HM175878 的第 262-288位)；Hb-Rl:5，-AGGTGCAGCTCACGCACTTCTGAACG-3，(Genbank:HM175878 的第 1980-2005位的反向互补序列)。(2) 3’端序列的获得将上述PCR扩增所获得的5’端序列与大麦模板序列(Genbank:HM175878)进行比对后发现，该序列与大麦模板序列(Genbank:HM175878)在3’非编码区(3’ UTR)的多个位点有差异。为了获得正确的3’ UTR序列，在编码区终止密码子TAA前约200bp处设计了扩增 3’ 端序列的引物 Hb-3RACE-GSPl。根据 BD SMARTTM RACE cDNAAmplification 试剂盒(Clontech，Cat.N0.634914，USA)的操作说明，以上述步骤中的cDNA为模板进行巢式PCR扩增。PCR 程序:94°C预变性 2min ;94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 lmin,30 个循环；72°C延伸7min，10°C保存。将PCR产物克隆到pGEM_T载体(Promega，USA)，单克隆在北京博迈德生物技术公司测序,获得3’端序列。Hb-3RACE-GSPl:5’ -CGACCTGTGCCTCTCCGATAGCGCCG-3’ (Genbank:HM175878 的第1204-1229 位，序列 2 的第 510-535 位)(3) HbSCaBP基因全长序列的获得将步骤(I)所获得的5’端序列和步骤(2)所得的3’端序列进行拼接，获得该基因的全长cDNA序列。结果显示，拼接所得的cDNA全长为1159bp，如序列表中序列2所示，其中第636位核苷酸为a。在多次实验的扩增过程中，本发明的发明人也得到过序列表中序列2的第636位核苷酸为g的情况。序列2的5’非翻译区84bp，3’非翻译区418bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，开放阅读框657bp (序列2的第85至741位)，将该基因命名为HbSCaBP。所述HbSCaBP基因编码序列表中序列I所示的蛋白质(HbSCaBP蛋白)。 二、HbSCaBP的进化树分析在NCBI的Genbank查询拟南芥、水稻和高粱的S0S3类似钙离子结合蛋白(SCaBP)家族成员登陆号。其中，10个拟南芥SCaBPs家族成员的Genbank =AtSCaBPI，AAC26009 ；AtSCaBP2, AAG28400 ；AtSCaBP3, AAG10059 ；AtSCaBP4, AAG28401 ；AtSCaBP5,AAC26008 ；AtSCaBP6, AAC26010 ；AtSCaBP7, AAL10301 ；AtSCaBP8, AA072364 ；AtSCaBP9,AAL10300 ;S0S3，AAG28402。10 个水稻 SCaBPs 家族成员的 Genbank:0sSCaBP01,ABA54176 ；0sSCaBP02, NP_001067190 ；0sSCaBP03, NP_001050704 ；0sSCaBP04, NP_001056148 ；0sSCaBP05, NP_001043483 ；0sSCaBP06, NP_001066223 ；0sSCaBP07, Q3HRP0 ；0sSCaBP08,Q3HRN9 ；0sSCaBP09, ABA54184 ；0sSCaBP10, Q3HRN7。8 个高粱 SCaBPs 家族成员的Genbank:SbSCaBPOI, FJ901259 ；SbSCaBP02, FJ901264 ；SbSCaBP03, FJ901265 ；SbSCaBP04,FJ901261 ；SbSCaBP05,FJ901263 ；SbSCaBP06, FJ901262 ；SbSCaBP07, FJ901260 ；SbSCaBP08,FJ901266。采用ClustalX软件将所有推导的氨基酸序列进行比对，结合邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统进化树，并采用Bootstraping法对进化树进行检验(bootstrap 值 >1000)。结果显示，与拟南芥、水稻和高粱SCaBP家族比对和系统进化树分析表明，HbSCaBP与拟南芥SCaBP家族中S0S3的同源最高(61%);在水稻SCaBP家族中，与0sSCaBP4/0sCBL4的同源性最高为82% ;在高粱SCaBP家族中，分别与SbSCaBP4/SbCBL4、SbSCaBP5/SbCBL5和SbSCaBP8/SbCBL8的同源性为63%、68%和62%。从分子进化树分析，HbSCaBP与S0S3、0sSCaBP4和SbSCaBP4属于同一亚族，在进化上它们属于直系同源体。可见步骤一中所述的序列表中序列I所示的蛋白质(ffiSCaBP蛋白)为S0S3类似钙离子结合蛋白。实施例2、HbSCaBP基因在不同生物胁迫下的表达分析将野大麦幼苗培养至两叶一心时，分别进行如下任一处理:350mM NaCl、350mM甘露醇、10%(质量分数)PEG6000或150 ii M ABA处理6h或24h ;4°C处理12h或48h。处理后，分别取根和莖，提取总RNA并消化DNA,根据Superscript III试剂盒(Invitrogen)进行反转录得到cDNA。同时以未经处理的野大麦幼苗根和茎作为对照。
米用在线软件Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/)根据 HbSCaBP 基因全长cDNA (序列2)设计特异引物Hb-F和Hb-R ;通过预试验确定18S rRNA为稳定表达的内参基因，参考如下文献“Michael W Christiansen, Preben B Holm and Per LGregersen.Characterization of barley(Hordeum vulgare L.)NAC transcriptionfactors suggests conserved functions compared to both monocots and dicots.BMC Research Notes2011, 4:302” 中引物(正向引物:5’-ACGGCTACCACATCCAAGGA-3’ ；反向引物:5’ -CAGGATTGGGTAATTTGCGC-3’)合成内参基因引物。先通过普通PCR扩增，并在2% (w/v)琼脂糖凝胶上验证引物的特异性。然后采用SYBR Premix Ex Taq (PerfectReal Time, Takara，Ca#DRR041A)在 Step One Plus 荧光定量 PCR 仪进行 Real-time PCR反应。PCR扩增程序:95°C预变性30s ;95°C变性5s，60°C退火30s，40个循环。反应体系(20u L):10u L SYBR Premix Ex Taq Master,0.4u L ROX Dye,2u L cDNA，上下游引物各10 u M,蒸懼水补足至 20 u L。在 MicroAmp Fast 0ptical96-ffell Reaction Plate (ABI,Ca#4346906)板并覆盖膜 MicroAmp Optical Adhesive Film (ABI, Ca#4311971)后于 PCR仪运行。米用 AGt 方法(参考文献:“Livak&Schmittgen, 2001.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the2 A ActMethod.Methods25, 402-408.，，)进行基因相对表达分析。
Hb-F:5’ -CACTGCCCTATCTCCAGGAC-3’(序列 2 的第 653-672 位)；Hb-R:5’ -GTGGCAGGCATGGITCTTAT-3’(序列 2 的第 738-757 位的反向互补序列)。结果如图2所示，在胁迫早期(6-12h)，350mM甘露醇、10%PEG6000和4°C冷胁迫后野大麦根、茎中HbSCaBP基因的表达量与未经处理的对照(CK)相比，差异均不明显；仅350mM NaCl胁迫下，HbSCaBP基因在野大麦根中的表达量显著增强，大约是对照(CK)表达量的18倍，而茎中的表达量变化不明显(图2中a)。这表明HbSCaBP基因表达具有时空特点，在各种胁迫早期其仅响应盐胁迫，说明该基因与耐盐性有关。在胁迫后期(24-48h)，350mM NaCl、350mM 甘露醇、10%PEG6000 和 150 u M ABA 胁迫 24h 后野大麦根、茎中 HbSCaBP基因表达量与未经处理的对照(CK)相比，差异均不显著；仅4°C冷胁迫48h后HbSCaBP基因在野大麦根部的表达量有所增加，约达到对照(CK)表达量的2.4倍，但茎叶中的表达量与对照相比仍不显著(图2中b)。这些表达分析进一步说明，野大麦HbSCaBP基因对渗透、冷和ABA胁迫响应不明显；在盐胁迫早期响应强烈，而在后期不明显，表明该基因有可能参与早期盐胁迫的信号传导或适应性基因的调控。实施例3、转HbSC aBP基因拟南芥植株的获得及其抗盐性鉴定一、转HbSCaBP基因拟南芥植株的获得1、重组表达载体pGreen0029_HbSCaBP的构建根据上述实施例1扩增得到的HbSCaBP基因(序列2)设计引物，加入BamH I和EcoR I酶切位点，引物序列如下:HbSCaBP-BamH1-F:5，-TGGATCCATGGGCTGCGTGTCGTCGTC-3，(下划线部分为 BamH I的识别序列，其后的序列为序列2的第85-104位)HbSCaBP-EcoR1-R:5’ -TGAATTCTTATTTGCTGATTCCGCTGTAATCGTCG-3’ (下划线部分为EcoR I的识别序列，其后的序列为序列2的第714-741位的反向互补序列)以人工合成的序列表中序列2所示的HbSCaBP基因为模板，用引物HbSCaBP-BamH1-F 和 HbSCaBP-EcoR1-R 进行 PCR 扩增，用限制性内切酶 BamH I 和 EcoR I对PCR产物进行双酶切，回收酶切产物，与经过同样双酶切的pGreen0029载体(含CaMV35S启动子和Nos终止子)相连，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证。将经测序表明在pGreen0029载体的多克隆位点BamH I和EcoR I之间插入了序列表中序列2的第85-741位所示DNA片段的重组质粒命名为PGreen0029-HbSCaBP。在重组表达载体pGreen0029-HbSCaBP中，启动HbSCaBP基因表达的启动子为CaMV35S启动子。2、转HbSCaBP基因拟南芥植株的获得将步骤I所得的重组表达载体pGreen0029_HbSCaBP和空载体pGreen0029分别电击转化到农杆菌Gv3101 (含助手载体pSoup)。将转入重组表达载体PGreen0029-HbSCaBP的农杆菌命名为Gv3101/pGreen0029-HbSCaBP ;将转入pGreen0029空载体的农杆菌命名为Gv3101/pGreen0029o制备转化菌液(5%蔗糖，0.05%Silwet L-77，前者为质量百分含量，后者为体积百分比；OD600=0.8 1.2)。按照Clough和Bent提出的蘸花法(参考文献“Clough
S.J.&Bent A.F., 1998.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journall6, 735-743，，)，用重组农杆菌Gv3101/pGreen0029-HbSCaBP和Gv3101/pGreen0029的转化菌液分别对拟南芥野生型Columbia和拟南芥突变体sos3进行浸染转化。收获Ttl代种子。在含50mg/L Kan的MS平板上筛选转化子，获得T1代抗性苗，将T1代抗性苗自交繁殖。一方面，筛选后代分离比为3:1的转入重组表达载体PGreen0029-HbSCaBP的拟南芥突变体sos3的T1代株系，从其自交后代(T2代)中筛选下一级后代(T3代)全部为Kan抗性的株系，获得纯合的转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3的T2代抗性苗。另一方面，收获T1代转入重组表达载体PGreen0029-HbSCaBP的拟南芥野生型Columbia株系的自交后代(T2代)，将T2代抗性苗通过自交繁殖，筛选后代分离比为3:1的T2代株系，从其自交后代(T3代)中筛选下一级后代(T4代)全部为Kan抗性的株系，获得纯合的转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia的T3代抗性苗。进一步对以上T2代或T3代的转HbSCaBP基因拟南芥苗进行PCR检测，以转HbSCaBP基因拟南芥苗的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为步骤I中的引物HbSCaBP-BamH1-F和HbSCaBP-EcoR1-R。同时设置转入空载体的拟南芥野生型Columbia和拟南芥突变体sos3植株作为两个空载体对照，设置未转基因的拟南芥野生型Columbia和拟南芥突变体sos3植株作为两个非转基因对照。PCR检测结果如图3所示，转入重组表达载体PGreen0029-HbSCaBP的拟南芥野生型Columbia和转入重组表达载体pGreen0029_HbSCaBP的拟南芥突变体sos3的不同T2或丁3代株系均扩增得到了长度约为660bp的片段。而用同样的引物对两个空载体对照和两个非转基因对照进行PCR检测，均未得到上述扩增片段。共获得11个独立的纯合T2代转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3株系，以及12个独立的纯合T3代转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia株系。从中挑选生长健康、种子量较多的3个T2代转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3纯合株系s5、s9和sl7，以及3个T3代转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia纯合株系W5、W11和W16用于下述步骤二的抗盐性鉴定分析。二、转HbSCaBP基因拟南芥植株的抗盐性鉴定1、实验方法以步骤一所得的T3代转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia纯合株系(W5、Wll和W16)和T2代转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3的纯合株系(s5、s9和sl7)为实验材料，进行如下发芽试验和幼苗生长试验分析转HbSCaBP基因拟南芥植株的抗盐性。同时设置转入空载体的拟南芥野生型Columbia和拟南芥突变体sos3植株作为两个空载体对照(分别记作CKl和CK2)，设置未转基因的拟南芥野生型Columbia和拟南芥突变体sos3植株作为两个非转基因对照(分别记作WT和sos3)。(I)发芽试验每株系至少选取60粒种子，进行消毒处理，铺在分别含不同浓度的NaCl(O、100、125、150mM)的MS平板上，4 °C沉积处理2天，在温度22-23 V，光照强度1000-3000 u mol ^nT 2s'光照时间16h/天的条件下生长2天，垂直放置生长7天，记录各株系发芽率。实验重复3次，结果取平均值。(2)幼苗生长试验将在MS平板上发芽5天的幼苗转移至含不同浓度的NaCl (O、100、125、150mM)的MS平板上，垂直生长2周后观察生长状况，每处理至少记录30株幼苗的鲜重，用于计算平均单株鲜重。实验重复3次，结果取平均值。2、结果(I) HbSCaBP基因在拟南芥突变体sos3过量表达可抑制敏盐表型T2代转HbSCaBP基因拟南芥突变体sos3的纯合株系(s5、s9和sl7)的发芽试验和幼苗生长试验的结果如图4所示。A.发芽试验在不含NaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥突变体sos3与转基因株系s5、s9和sl7的发芽率均为100%，没有差别；在含IOOmM NaCl的MS平板上，转基因株系s5、s9和sl7的平均发芽率分别为85%、90%和88%，而未转基因的拟南芥突变体sos3的发芽率下降为20%，转基因株系与亲本对照发芽率呈极显著差异(p〈0.01)，表明拟南芥突变体sos3具有明显的敏盐表型；在含125mM NaCl的培养基上，未转基因的拟南芥突变体sos3发芽率将至9%，而3个转基因系发芽率达到约58-69%，转基因株系与亲本对照发芽率呈极显著差异(p〈0.01)，表明HbSCaBP基因在拟南芥突变体sos3过表达可互补其敏盐表型；在含150mMNaCl的培养基上拟南芥突变体sos3几乎不发芽(发芽率低于5%)，而3个转基因系仍发芽(37-45%)，进一步表明，HbSCaBP基因在拟南芥突变体sos3过表达能够互补其敏盐性(图4中a)。转入空载体的拟南芥突变体sos3植株(CK2)的实验结果与未转基因的拟南芥突变体sos3基本一致,无统计学差异。B.幼苗生长试验在不含NaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥突变体sos3与转基因株系s5、s9和sl7，以及未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)的生长表型及单株鲜重没有差别；随着盐浓度的增加，3个转基因株 系s5、s9和sl7，以及未转基因的拟南芥野生型Columbia(WT)幼苗生长变慢，单株幼苗鲜重下降，但三个不同的盐浓度下的测定结果差异不显著，而未转基因的拟南芥突变体sos3在含IOOmM NaCl的MS平板上生长2周后变褐，停止生长，其单株鲜重与未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)呈极显著差异(p〈0.01);在含125_150mMNaCl的培养基上未转基因的拟南芥突变体sos3在5天后就开始白化，不再生长，而转基因株系s5、s9和sl7与未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)大部分仍呈绿色，且转基因株系s5、s9和sl7的鲜重显著大于未转基因的拟南芥突变体sos3的鲜重(图4中b和C)。转入空载体的拟南芥突变体sos3植株(CK2)的实验结果与未转基因的拟南芥突变体sos3基本一致，无统计学差异。以上发芽试验和幼苗生长试验的结果充分表明，HbSCaBP基因能够互补拟南芥突变体sos3的敏盐表型。(2) HbSCaBP基因在拟南芥野生型Columbia过量表达可提高抗盐性T3代转HbSCaBP基因拟南芥野生型Columbia的纯合株系(W5、W11和W16)的发芽试验和幼苗生长试验的结果如图5所示。A.发芽试验在不含NaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥野生型Columbia(WT)与3个转基因株系W5、W11和W16的发芽率均为100%，没有差别，表明3个转基因株系在发芽方面均正常；在含IOOmM NaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)和3个转基因株系W5、W11和W16的发芽率均降低，但野生型(WT)与3个转基因株系发芽率的差异不明显；当NaCl浓度增加至125mM时，未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)发芽率降低的幅度大于3个转基因株系，3个转基因株系W5、W11和W16发芽率均显著高于野生型(WT)发芽率(p<0.01);特别是在含150mMNaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)基本不能发芽，而3个转基因株系仍能够发芽，发芽率约为11-16% (图5中a)。转入空载体的拟南芥野生型Columbia植株(CKl)的实验结果与未转基因的拟南芥野生型Columbia基本一致，无统计学差异。B.幼苗生长试验在不含NaCl的MS平板上，未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)与3个转基因株系W5、Wll和W16的生长表型及单株鲜重均没有差别；随着盐浓度的增加，3个转基因株系W5、Wll和W16，以及未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)幼苗生长变慢，单株鲜重下降，但转基因株系下降的幅度比野生型(WT)小；在150mMNaCl的MS平板上未转基因的拟南芥野生型Columbia (WT)植株胁迫2周后开始白化，而3个转基因株系W5、W11和W16幼苗的生长速率显著高于野生型，主要表现在转基因株系的平均单株鲜重显著大于野生型(WT)的平均单株鲜重(图5中b和C)。转入空载体的拟南芥野生型Columbia植株(CKl)的实验结果与未转基因的拟南芥野生型Columbia基本一致,无统计学差异。以上发芽试验和幼苗生长试验的结果充分表明，HbSCaBP基因能够提高拟南芥野生型Columbia的抗盐性。总之，HbSCaBP基因不论在拟南芥敏盐突变体(拟南芥突变体sos3)还是在拟南芥野生型Columbia中过表 达,均可提高植株的耐盐性。
权利要求
1.由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下al)或a2)中的应用: al)调控植物抗盐性； a2)选育抗盐植物品种。
2.由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下al)或a2)中的应用: al)调控植物抗盐性； a2)选育抗盐植物品种。
3.培育耐盐转基因植物的方法，包括如下步骤: a)向目的植物中导入由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比耐盐性提高的转基因植物。
4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I) 或2)限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
7.下述任一生物材料: (I)蛋白质，是如下a)或b): a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列I衍生的蛋白质； (II)编码(I)中所述蛋白质的核酸分子；所述核酸分子是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子； 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子； (II)含有(II)中所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
9.根据权利要求5所述的方法，或权利要求8所述的生物材料，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35s启动子。
10.权利要求7中所述的重组载体、所述的表达盒、所述的转基因细胞系或所述的重组菌在如下al)或a2)中的应用: al)调控植物抗盐性； a2)选育抗盐植物品种； 所述植物具体为双子 叶植物或单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种抗逆相关钙调磷酸酶B类似蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)或a2)中的应用a1)调控植物抗盐性；a2)选育抗盐植物品种。实验证明，由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在拟南芥突变体sos3过表后可抑制其敏盐表型，在拟南芥野生型Columbia过表达后可提高植株的耐盐性。
文档编号C12N15/82GK103172719SQ20131007062
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者李瑞芬, 陈亚娟, 魏建华, 王宏芝 申请人:北京农业生物技术研究中心