专利名称：用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术、杆状病毒基因表达系统，尤其涉及一种利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统在家蚕内表达人体内皮血管生长因子和纯化的方法。
背景技术：
家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一。申请人利用 细菌转座子原理构建了专门用于家蚕的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(参见论 文吴小锋，曹翠平，鲁兴萌。2006，利用细菌转座子构建适用于家蚕的Bac-to-Bac 快速基因表达系统。蚕业科学，32 (2): 183-188)。该系统的优点在于重组杆状 病毒可以通过细菌转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内实现基因的转移 重组，快速获得重组病毒，构建了可利用我国特色资源昆虫一家蚕的Bac-to-Bac 快速基因表达系统。该系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组 的感受态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是首先将外源目的 基因克隆入供体质粒，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通 过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基 因组而产生重组病毒DNA，最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病 毒。申请人尝试利用该系统快速产生能够表达人体内皮血管生长因子的重组病 毒，并利用家蚕作为寄主表达何生产重组人体内皮血管生长因子蛋白，并利用 亲和层析技术建立分离该蛋白的方法。
发明内容
本发明公开了一种用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法。 主要包含两个方面的内容， 一个是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有 人体内皮血管生长因子的重组病毒的方法， 一个是利用肝糖层析柱从感染的家 蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下 1、利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重 组病毒的方法
将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的 供体质粒pFastBacHT多克隆位点，供体质粒为美国Invitrogene公司产品，使该 基因位于杆状病毒多角体启动子下游，然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒
BmBacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上 培养13小时后，通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提质粒 DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组，将此DNA转染入家蚕培养细胞 BmN， 120小时后分离培养基上清液，获得含有人体内皮血管生长因子基因的重 组病毒。
2、利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法利用注 射法将20微升上述重组病毒注射入家蚕五龄幼虫，120小时后收集感染的家蚕 样品，然后加入磷酸缓冲液并匀浆样品，高速离心后取上清液，将上清液作为 提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料，利用肝糖亲和层析柱分离、纯化 获得相应的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质纯度。
本发明具有的有益效果是利用家蚕Bac-to-Bac表达系统能够快速产生含 有人体内皮血管生长因子基因的重组杆状病毒，并在家蚕幼虫内高效表达，利 用肝糖亲和层析柱实现重组蛋白的快速分离和纯化。
附图是供体质粒pFastBacHT图。
具体实施例方式
1、 研究材料家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统由申请人开发完成，并已 公开发表，(参见论文吴小锋，曹翠平，鲁兴萌。2006，利用细菌转座子构建 适用于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统。蚕业科学，32 (2): 183-188)。供 体质粒pFastBacHT (图1)购自美国Invitrogen公司。各种限制性内切酶、连接 酶等分子生物学操作试剂购自日本Takara公司。人体内皮血管生长因子基因购 自美国Clontech公司。肝糖亲和层析柱Heparin Sepharose购于美国GE公司。
2、 工作流程
将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的 供体质粒pFastBacHT多克隆位点BamHI和HindIII之间，使该基因位于杆状病 毒多角体启动子下游，然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因 组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在添加了卡那霉素(浓度50微克/ML)、 庆大霉素(浓度35微克/ML)两种抗生素以及半乳糖苷类似物X-Gal的培养板上 培养13小时后，通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑(白斑，即基因发生了插入重组)， 随后从阳性菌斑从抽提大质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组，将 此DNA转染入家蚕单层培养细胞BmN内，120小时后分离培养基上清液，获 得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒。将20微升上述重组病毒通过经
皮注射的方式接种家蚕五龄幼虫，然后观察家蚕的发病情况，120小时后收集被 病毒感染的家蚕，然后以每头家蚕2毫升的比例加入PH7.2d的磷酸缓冲液，并 采用匀浆器对样品精心匀浆处理，再高速离心后取上清液，将上清液作为提取 重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料。利用肝糖亲和层析柱Heparin Sepharose 分离、纯化获得相应的蛋白质，将上述原料加入层析柱使之与树脂结合，最后 用含有1.5M的NaCl溶液一步洗脱、分离重组的人体内皮血管生长因子蛋白。 纯化的样品利用SDS-PAGE电泳分析纯化的蛋白质纯度。
根据实际结果，每头家蚕幼虫的产量估计在600微克左右。
权利要求
1、用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法，其特征在于该方法的步骤如下1)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒的方法将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的供体质粒pFastBacHT多克隆位点，使该基因位于杆状病毒多角体启动子下游，然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上培养13小时后，通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组，将此DNA转染入家蚕培养细胞BmN，120小时后分离培养基上清液，获得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒；2)利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法利用注射法将20微升上述重组病毒注射入家蚕五龄幼虫，120小时后收集感染的家蚕样品，然后加入磷酸缓冲液并匀浆样品，高速离心后取上清液，将上清液作为提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料，利用肝糖亲和层析柱分离、纯化获得相应的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质纯度。
全文摘要
本发明公开了一种用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法。该方法的步骤如下利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重组病毒；利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质。本发明利用家蚕Bac-to-Bac表达系统能够快速产生含有人体内皮血管生长因子基因的重组杆状病毒，并在家蚕幼虫内高效表达，利用肝糖亲和层析柱实现重组蛋白的快速分离和纯化。
文档编号C12N7/01GK101381726SQ20081012160
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日
发明者吴小锋, 相兴伟, 琳 陈 申请人:浙江大学