一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用的制作方法

一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用。本发明公开的一种羊毛硫细菌素cerecidin是一种修饰的多肽。本发明的羊毛硫细菌素cerecidin的合成方法比传统方法简单。同时，合成的cerecidin具有较高的抑菌活性，耐万古霉素粪肠球菌V583（VRE）抑菌效果比nisin要好，且cerecidin在较广的pH条件下及高温下都比较稳定。
【专利说明】—种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用。
【背景技术】
[0002]羊毛硫细菌素是一种由革兰氏阳性菌(如乳酸菌)产生的，通过核糖体合成并经过翻译后修饰形成的具有生物活性的抗菌肽。它们被认为是潜在的抗生素替代物，对特定的革兰氏阳性致病菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌或新青霉素抗性菌具有较强的抑菌活性。作为目前研究的最为清楚的羊毛硫细菌素，nisin由于其具有优良的抑菌活性，已经作为一个天然的安全的食品防腐剂广泛应用于世界上80多个国家，并且在其使用的40余年中未引起严重的细菌耐药反应，应用效果理想。但nisin本身在抗逆性方面存在一些不足，如只在低PH条件下(pH〈7)稳定以及耐高温性(大于100°C)较差。新型羊毛硫细菌素越来越多的被发现，目前已经报道的羊毛硫细菌素至少有50种。其中，mutacinll40、duramycin、gallidermin、lacticin3147 和 microbisporicin 等已经处于临床前研究阶段。但目前尚无一种羊毛硫细菌素被开发成为商品化药物，一方面因为羊毛硫细菌素的抑菌谱较窄且对特定耐药菌活性较弱，另一方面因为羊毛硫细菌素的抗逆性较差。因此，开发新的具有更高活性且抗逆性强的羊毛硫细菌素在食品及医药应用方面具有重要的研究价值。传统方法主要通过筛选具有天然产生抑菌活性物质的菌株并通过发酵获得新的羊毛硫细菌素，这种方法耗时且工作量大，并具有一定的随机性。因此，建立新的羊毛硫细菌素合成方法对于开发新的并且具有应用价值的羊毛硫细菌素具有重要意义。

【发明内容】

[0003]本发明的目的是提供一种新型高效的羊毛硫细菌素cerecidin及其应用。
[0004]本发明所提供的一 种羊毛硫细菌素cerecidin，是一种修饰的多肽，该多肽的结构如下:
[0005]骨架氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中第I位氨基酸Thr发生脱水后与第5位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第I位氨基酸Thr和第5位氨基酸Cys形成甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala，第15位氨基酸Ser发生脱水后与第19位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第15位氨基酸Ser和第19位氨基酸Cys形成羊毛硫氨酸Ala_S_Ala，第I位至第5位氨基酸形成A环，第15位至第19位氨基酸形成B环，第2位氨基酸Thr与第13位氨基酸Thr发生脱水分别形成脱氢丁氨酸。
[0006]上述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0007]上述编码基因中，所述的编码基因为如下中至少一种:
[0008]I) SEQ ID N0.2中自5’末端起第172位至231位核苷酸所示的DNA分子；
[0009]2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码上述多肽的DNA分子；
[0010]3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码上述多肽的DNA分子。[0011]含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0012]上述多肽在制备抑制革兰氏阳性致病菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0013]上述应用中,所述革兰氏阳性致病菌为黄色微球菌(Micrococcus flavus)和/或幾肠球菌(Enterococcus faecalis)；
[0014]和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。
[0015]上述多肽在制备具有pH稳定性和/或热稳定性的抑菌多肽中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016]上述应用中，所述pH稳定性指在pH值为2-12的条件下所述多肽的抑菌活性稳定;
[0017]所述热稳定性为在100°C下处理O-Sh后所述多肽的抑菌活性稳定。
[0018]上述应用中，所述菌为黄色微球菌(Micrococcus flavus)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；
[0019]和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。
[0020]一种制备上述的多肽的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:
[0021](I)将SEQ ID N0.2所示的DNA连入大肠杆菌的重组表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入大肠 杆菌中，得到重组大肠杆菌；
[0022](2)利用所述重组大肠杆菌进行原核表达，收集菌体；
[0023](3)将菌体破碎，离心，收集上清；
[0024](4)将所述上清用Ni亲和柱进行纯化，收集纯化产物；
[0025](5)将纯化产物与胰蛋白酶共孵育，37°C反应l_4h，得到反应产物；
[0026](6)去除所述反应产物中的胰蛋白酶；
[0027](7)将步骤(6)所得产物进行高效液相色谱纯化，220nm处检测洗脱峰，收集22.3min处的洗脱峰；
[0028]所述高效液相色谱纯化的条件如下:
[0029]C18 柱型号为 Shim-pack VP-ODS,内径 4.6mm,柱长 250mm,填充介质为 C18 ；
[0030]流动相由A液和B液组成；
[0031]A液:由H2O和三氟乙酸组成，三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1% ；
[0032]B液:由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1% ；
[0033]流动相中B液的体积百分含量梯度为30%_65%，进行线性洗脱；
[0034]上样量为500ul，流动相的流速为lml/min。
[0035]上述方法中，所述步骤(6)中，所述去除反应产物中的胰蛋白酶的方法为:反应结束后，将所述反应物65°C加热IOmin, 12000rpm离心5min,弃去沉淀部分，以此除去所述的
膜蛋白酶。
[0036]本发明的羊毛硫细菌素cerecidin的合成方法比传统方法简单并且羊毛硫细菌素cerecidin的产量高。同时，合成的cerecidin具有较高的抑菌活性,对耐万古霉素粪肠球菌V583 (VRE)的抑菌效果比nisin要好,且cerecidin在较广的pH条件下及高温下都比较稳定。【专利附图】

【附图说明】
[0037]图1为cerecidin的高效液相纯化图。
[0038]图2为cerecidin的质谱图。
[0039]图3为cerecidin的串联质谱分析。
[0040]图4为cerecidin的合成过程图。
[0041]图5为cerecidin和nisin的抑菌活性比较。
[0042]图6为cerecidin对pH和高温的耐受性。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]LB培养基(1000ml):用于大肠杆菌的培养；
[0046]胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaClIOgJP ddH20定容至1000ml得到液体培养基。
[0047]SI培养基(1000ml):用于黄色微球菌NCIB8166的培养；
[0048]胰蛋白胨8g,酵母粉 5g,葡萄糖 5g, NaC15g, Na2HP042g, Tween_201ml,加 ddH20 定容至1000ml得到液体培养基。`
[0049]GMl7培养基(1000ml):用于粪肠球菌V583 (VRE)的培养；
[0050]细菌蛋白胨5g,大豆蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g, β _磷酸甘油二钠19g,维生素C0.5g, IM MgSO4ImL,葡萄糖5g,加ddH20定容至1000ml得到液体培养基。
[0051]上述培养基均为液体培养基，相对应的固体培养基要再加入15g琼脂粉。
[0052]腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，AS编号为1.1846。
[0053]TES buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为蔗糖和EDTA，Tris-HCl缓冲液的浓度为25mM，EDTA在TES buffer中的浓度为10mM，蔗糖在TES buffer中的浓度为10%，％表示质量体积百分数(g/100ml)。
[0054]lysis buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为EDTA、NaCl和SDS, Tris-HCl 缓冲液的浓度为 lOOmM，EDTA 在 lysis buffer 中的浓度为 lOOmM，NaCl 在lysis buffer中的浓度为IOmM, SDS在lysis buffer中的浓度为1%，％表示质量体积百分数(g/100ml)。
[0055]pET28a ( + )购自Merck公司，产品目录号为69864-3。
[0056]杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为EDTA和NaCl，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，EDTA在杂交缓冲液中的浓度为lmM，NaCl在杂交缓冲液中的浓度为IOOmM,杂交缓冲液的pH为7.4。
[0057]start buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04、NaCl和咪唑，Na2HPO4在start buffer中的浓度为50mM,NaCl在start buffer中的浓度为500mM,咪唑在startbuffer 中的浓度为 20mM, start buffer 的 pH 为 7.4。
[0058]wash buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04、NaCl和咪唑，Na2HPO4在wash buffer中的浓度为50mM, NaCl在wash buffer中的浓度为500mM,咪唑在washbuffer 中的浓度为 40mM, wash buffer 的 pH 为 7.4。
[0059]elution buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HP04、NaCl和咪唑，Na2HPO4 在 elution buffer 中的浓度为 50mM, NaCl 在 elution buffer 中的浓度为 500mM，咪唑在 elution buffer 中的浓度为 500mM, elution buffer 的 pH 为 7.4。
[0060]黄色微球菌NCIB8166 (Micrococcus flavus NCIB8166)在文献“Xiao, H.，Χ.Chen, Μ.Chen, S.Tang, X.Zhao, and L.Huan.2004.Bovicin HJ50, a novel lantibioticproduced by Streptococcus bovis HJ50.Microbiologyl50:103-108.” 中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0061]幾肠球菌V583 (VRE) (Enterococcus faecalis V583)在文献“Paulsen, 1.，L.Banerjei, G.Myers, K.Nelson, R.Seshadri, T.Read, D.Fouts, J.Eisen, S.Gill, andJ.Heidelberg.2003.Role of mobile DNA in the evolution of vancomycin-resistantEnterococcus faecalis.Science299:2071-2074.”中公开过，公众可从美国模式培养物集存库(ATCC)获得，ATCC编号为700802，该菌为耐万古霉素菌。
[0062]实施例1、表达载体的构建及突变
[0063]一、提取蜡状芽孢杆菌基因组DNA
[0064](一)收集1.0-1.5ml过夜培养的稳定期的腊状芽孢杆菌ASl.1846 (Bacilluscereus ASl.1846)菌液。
[0065](二)I X 104rpm,离心 30_60s,弃去上清。
[0066](三)用100μI含30mg/ml溶菌酶的TES buffer重悬菌体沉淀，在37°C下静置
1.5h。`
[0067](四)加入600μ1lysis buffer,颠倒离心管,轻轻混匀,在室温下放置10_15min
(直至澄清)。
[0068](五)加入10μ1 proteinase K (10mg/ml), 37°C 下放置 15min。
[0069](六)80°C加热5min,冷却至室温。
[0070](七)加入200μ I乙酸钠(3Μ，ρΗ5.2)，混匀，放置于冰上10_15min。
[0071](八)4°C,2X104rpm离心IOmin,沉淀蛋白至完全。
[0072](九)小心吸取上清至新的离心管中，向其中加入等体积(约600μ I)的异丙醇，轻轻颠倒几次。
[0073](十)2X 104rpm 离心 5min。
[0074](十一)弃去上清，加入Iml体积百分含量为70%的乙醇洗涤沉淀(即DNA)，在室温下烘干。
[0075](十二)重悬DNA沉淀于30μ I双蒸水中。
[0076](十三)进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0077]二、PCR 扩增
[0078]以步骤一提取的基因组DNA为模板，扩增cerAM基因(包括cerecidin前体基因cerA及修饰基因cerM)。所用引物如下:
[0079]cerA-F (Bam HI):5，-CGGGATCCATGTCAAAAGGATACAAGTTC-3> ；
[0080]cerM-R (Xho I):5’ -CCGCTCGAGTTATCCTTTTACATTTTCTAATG-3’。
[0081](下划线所示序列为酶切位点)[0082]PCR反应体系为:
[0083]
Transtart FastPfu DNA 聚合酶(2.5 U/ μ I)0.7 μ I
SXBuffer10 μ I
dNTP混合物4 μ I
基因组DNA模板0.5 μ?
引物 cerA-F (10 mM)2.5 μ I
引物 cerM-R (10 mM)2.5 μ I
双蒸水29.8 μ I
[0084]PCR 程序为:95°C预变性 5min ；94°C 45s，55。。30s, 72°C 2min，30 个循环；72°C充分延伸lOmin。
[0085]三、回收PCR产物，溶于40 μ I去离子水中。
[0086]四、Bam HI和Xho I双酶切PCR产物，得到cerAM基因片段；Bam HI和Xho I双酶切pET28a ( + )载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pET28a_cerAM0
[0087]五、将重组质粒pET28a-cerAM 转化 E.coli BL21 (DE3)，得到 E.coli BL21 (DE3)/ρΕΤ28βιθι?Μ，重组质粒经测序验证正确。测序表明cerAM基因的核苷酸序列为SEQ ID
N0.10
[0088]六、采用连接酶非依赖的定点突变技术定点突变CerA中前导肽末端(CerA中-1位)Glu为Lys,具体步骤如下:
[0089](一)设计突变引物。
[0090]突变引物如下:
[0091]E-1K-FL:5’ -CAACCAAAAACAACACCGCTTTGTGTGGGA-3> ；
[0092]E-1K-RL:5’ -TGTTTTTGGTTGTACATCTGATGCCCCTTG-3’ ；
[0093]E-1K-RS:5，-TACATCTGATGCCCCTTGAATTTCC-3，；
[0094]E-1K-FS:5，-ACACCGCTTTGTGTGGGAGTCATTAT-3，。
[0095]在长引物(L)中引物突变位点如下划线所示，AAA编码Lys。
[0096]E-1K-FL 和 E-1K-RS 为一对引物，E-1K-RL 和 E-1K-FS 为一对引物。
[0097](二)两对引物分别以载体pET28a_cerAM为模板进行PCR。
[0098]PCR 程序为:95°C预变性 5min ；94°C 45s，55。。30s, 72°C 7min，30 个循环；72°C充分延伸lOmin。
[0099](三)将PCR得到的两种片段混合回收，将混合物溶于20μ I去离子水中，加入
2.4 μ IlOXBuffer以及I μ I的Dpn I酶，置于37°C的水浴锅中反应3hr，以彻底消化用于PCR扩增的模板DNA。
[0100](四)回收经过DpnI酶消化后的两种PCR片段，溶解于20 μ I杂交缓冲液中，94°C变性3min后，进行4个循环的退火杂交反应(每个循环为65°C 2min，25°C 15min)，得到含有切口 的 pET28a-cerAM (E-1K)。[0101](五)取5μI步骤(四)得到的退火杂交反应产物转化Ε.coli BL21 (DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素(50 μ g/ml)的LB平板，37°C倒置培养过夜。
[0102](六)从平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素(50μ g/ml)的LB试管中，37°C震荡培养过夜。
[0103](七)提取质粒DNA，即为pET28a_cerAM(E_1K)。将质粒进行测序，测序结果表明，连入载体的DNA片段的序列SEQ ID N0.2所示。将含有突变质粒的大肠杆菌命名为E.coliBL21 (DE3)/pET28a-cerAM (E-1K)0
[0104]实施例2、蛋白的诱导表达及体外加工
[0105]一、挑取 E.coli BL21(DE3)/pET28a-cerAM (E-1K)的单菌落接种到 IOml LB 培养液(含50 μ g/ml Kan)中，37°C振荡培养过夜。
[0106]二、按体积比1:100的比例转接培养过夜的菌液至I升新鲜的LB培养液(含
50μ g/ml Kan)中，37°C、220rpm振荡培养约2_3h。当菌液浓度至OD600为0.6-0.8 (对数生长中期)时，加入IPTG至终浓度为0.25-lmM。
[0107]三、将培养温度调至18°C，160rpm振荡培养16-20h后，4°C，5000rpm离心20min收集菌体，菌体沉淀可以保存在-80°C备用。
[0108]四、菌体解冻并重悬于25ml的start buffer。
[0109]五、超声破碎菌体后，10，000rpm,4°C离心30min,收集上清。
[0110]六、将上清用0.45nm的滤膜过滤得到滤液。
[0111]七、将ImL N1-NTA结合树脂(购自GE)装入柱子,用start buffer平衡柱子。
[0112]八、将滤液上柱后，用15ml的wash buffer洗去杂蛋白，再用4ml的elutionbuffer洗脱目的蛋白，将其命名为His6-CerAm (E-1K)。
[0113]九、将洗脱得到的目的蛋白His6-CerAm (E-1K)与胰蛋白酶trypsin共孵育,37?反应l-4h。
[0114]十、反应结束后,65 °C加热lOmin, 12000rpm离心5min,保留含有目的多肽cerecidin的上清部分,弃去沉淀部分以此除去胰蛋白酶以备后续高效液相纯化。
[0115]十一、使用C18反相制备柱进一步纯化。
[0116]C18 柱型号为 Shim-pack VP-0DS,内径 4.6mm,柱长 250mm,填充介质为 C18。
[0117]流动相由A液和B液组成。
[0118]A液:由H2O和三氟乙酸(Trifluoretic acid, TFA)组成,三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1% ；
[0119]B 液:由乙臆(Acetonitrile, ACN)和三氟乙酸(Trifluoretic acid, TFA)组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1% ；
[0120]流动相中B液的体积百分含量梯度为30%_65%，进行线性洗脱。
[0121]上样量为500 μ 1，流动相的流速为lml/min ；
[0122]采用220nm波长进行蛋白检测。
[0123]步骤(十)的上清的高效液相纯化图谱如图1所示。
[0124]图1表明，目的多妝cerecidin的出峰时间为22.3min。
[0125]十二、对纯化后的cerecidin进行质谱鉴定，测得cerecidin的分子量为1958.13Da，与理论分子量2030.17Da相差72.04Da，表明发生了四分子脱水修饰，质谱鉴定结果如图2所示。
[0126]十三、串联质谱确定cerecidin的结构
[0127]采用MALD1-TOF MS/MS鉴定cerecidin结构:在一级质谱的基础上，选择对应分子量为1958.13Da的母离子进行二级串联质谱，串联质谱分析结果如图3所示。
[0128]cerecidin的合成过程如图4所示。
[0129]cerecidin 的结构如图 4 中 “cerecidin” 所不。
[0130]cerecidin 的结构如下:
[0131]cerecidin的编码基因为SEQ ID N0.2中自5’末端起第172位至231位核苷酸所示的DNA分子。
[0132]cerecidin的骨架氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中第I位氨基酸Thr发生脱水后与第5位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第I位氨基酸Thr和第5位氨基酸Cys形成一个特殊氨基酸即甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala ；
[0133]第15位氨基酸Ser发生脱水后与第19位氨基酸Cys形成硫醚键_S_，第15位氨基酸Ser和第19位氨基酸Cys形成一个特殊氨基酸即羊毛硫氨酸Ala-S-Ala ；
[0134]第I位至第5位氨基酸形成A环，第15位至第19位氨基酸形成B环；
[0135] 第2位氨基酸Thr与第13位氨基酸Thr只发生脱水分别形成Dhb (脱氢丁氨酸)，不参与成环。
[0136]实施例3、cerecidin的抑菌活性测定
[0137]采用挖井扩散法测定cerecidin的抑菌活性。
[0138]一、指示菌平板的制备:
[0139](一)用含SI培养基的平板培养黄色微球菌NCIB8166，并在冰箱中放置20天左右，挑取一环黄色微球菌NCIB8166于生理盐水中，悬浮混匀，取0.5ml悬浮液加入融化的20mlSI固体培养基中混匀，倒入直径90mm的培养皿中，平放，得到黄色微球菌NCIB8166的指示菌平板。
[0140](二)用含GMl7培养基的平板培养粪肠球菌V583 (VRE)，并在冰箱中放置20天左右，挑取一环粪肠球菌V583 (VRE)于生理盐水中，悬浮混匀，取0.5ml悬浮液加入融化的20ml GMl7固体培养基中混匀，倒入直径90mm的培养皿中，平放，得到粪肠球菌V583 (VRE)指示菌平板。
[0141]二、用打孔器在各指示菌平板上打出直径5mm的小孔，将25ull0ug/ml的cerecidin加入到小孔中，以相同体积和浓度的nisin作为正对照,将平板放入培养箱培养。结果如图5所示。
[0142]图5表明，cerecidin对黄色微球菌NCIB8166抑菌活性较nisin低，但对粪肠球菌V583 (VRE)抑菌活性较nisin高。
[0143]三、最低抑菌浓度(MIC)的测定
[0144]最低抑菌浓度(MIC)定义为抑制细菌生长超过起始浓度50%时所需的最低细菌素浓度。
[0145](一)各指示菌(黄色微球菌NCIB8166和粪肠球菌V583(VRE))在相应的液体培养基条件下生长到OD6tltl为1.0,并用相应的培养基稀释到0D_为0.1-0.15。
[0146](二)取150ul各指示菌稀释液分别加入到96孔板中，制成两种指示菌的96孔板。[0147](三)在每种指示菌的96孔板中分别加入用无菌水配制的从32ug/ml到0.016ug/ml 二倍梯度稀释的cerecidin和nisin溶液，每孔设三个平行，结果取平均值。
[0148](四)将各指示菌的96孔板分别在如下条件下进行培养，并在终点处测定OD6tltl值。
[0149]黄色微球菌NCIB8166平板30°C培养24h ；
[0150]粪肠球菌V583 (VRE)平板37°C培养12h ；
[0151]测定结果如表1所示。
[0152]表1 表明，cerecidin 对黄色微球菌 NCIB8166 的 MIC 为 0.125ug/ml,而 nisin 为
0.03125ug/ml ；cerecidin 对幾肠球菌 V583 (VRE)的 MIC 为 2ug/ml,而 nisin 为 8ug/ml。
[0153]表1cerecidin和nisin的最低抑菌浓度(MIC)测定
【权利要求】
1.一种羊毛硫细菌素cerecidin,是一种修饰的多肽,该多肽的结构如下: 骨架氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中第I位氨基酸Thr发生脱水后与第5位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第I位氨基酸Thr和第5位氨基酸Cys形成甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala，第15位氨基酸Ser发生脱水后与第19位氨基酸Cys形成硫醚键-S-，第15位氨基酸Ser和第19位氨基酸Cys形成羊毛硫氨酸Ala_S_Ala，第I位至第5位氨基酸形成A环，第15位至第19位氨基酸形成B环，第2位氨基酸Thr与第13位氨基酸Thr发生脱水分别形成脱氢丁氨酸。
2.权利要求1所述多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种: .1)SEQ ID N0.2中自5’末端起第172位至231位核苷酸所示的DNA分子； . 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述多肽的DNA分子； .3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述多肽的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的多肽在制备抑制革兰氏阳性致病菌的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述革兰氏阳性致病菌为黄色微球菌(Micrococcus flavus)和 / 或幾肠球菌(Enterococcus faecalis)； 和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。
7.权利要求1所述的多肽在制备具有pH稳定性和/或热稳定性的抑菌多肽中的应用； 所述PH稳定性指在pH值为2-12的条件下所述多肽的抑菌活性稳定； 所述热稳定性为在100°C下处理O-Sh后所述多肽的抑菌活性稳定。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述菌为黄色微球菌(MicrococcusfIavus)和 / 或幾肠球菌(Enterococcus faecalis)； 和/或，所述粪肠球菌为耐万古霉素的粪肠球菌。
9.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，包括如下步骤: (1)将SEQID N0.2所示的DNA连入大肠杆菌的重组表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌； (2)利用所述重组大肠杆菌进行原核表达，收集菌体； (3)将菌体破碎，离心，收集上清； (4)将所述上清用Ni亲和柱进行纯化，收集纯化产物； (5)将纯化产物与胰蛋白酶共孵育，37°C反应l_4h，得到反应产物； (6)去除所述反应产物中的胰蛋白酶； (7)将步骤(6)所得产物进行高效液相色谱纯化，220nm处检测洗脱峰，收集22.3min处的洗脱峰； 所述高效液相色谱纯化的条件如下: C18柱型号为Shim-pack VP-ODS,内径4.6mm,柱长250mm,填充介质为C18 ； 流动相由A液和B液组成； A液:由H2O和三氟乙酸组成,三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1% ； B液:由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1% ；流动相中B液的体积百分含量梯度为30%-65%，进行线性洗脱； 上样量为500ul，流动相的流速为lml/min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述步骤(6)中，所述去除反应产物中的胰蛋白酶的方法为:反应结束后，将所述反应物65°C加热10min，12000rpm离心5min，弃去沉淀部分，以此除去所述 的胰蛋白酶。
【文档编号】C12N15/63GK103483433SQ201310409912
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】钟瑾, 王剑 申请人:中国科学院微生物研究所