微流体细胞处理芯片及其应用方法
【专利摘要】本发明涉及一种微流体细胞处理芯片及应用方法，由底层和顶层构成，顶层中设有蛇形管道和细胞操作腔，蛇形管道的溶液流入口上设有两个流入通道，两个流入通道的入口管道上分别设有保护剂入口和缓冲溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道连接细胞操作腔，细胞操作腔设有溶液出口和细胞进出口通道，细胞进出口通道上装有转矩控制微阀，细胞操作腔的两侧各设有一个半隔断，能够将细胞限制于细胞操作腔中，而不被冲走。通过转矩控制微阀的开闭来控制细胞进出细胞操作腔。本发明的微流体细胞处理芯片及应用方法可以在对体积较大的动物细胞冷冻保护剂加载或去除时，使保护剂浓度连续变化，具有操作直接简便、对细胞损伤较小等优点。
【专利说明】微流体细胞处理芯片及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微流体细胞处理芯片，具体说，是涉及一种以对细胞损伤小，操作简便显著，在低温保护剂的加载和去除过程中，能使低温保护剂浓度连续改变的微流体芯片及其应用方法。
【背景技术】
[0002]细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于_196°C液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。细胞冻存时向培养基中加入保护剂一终浓度5%-15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
[0003]卵母细胞作为一种体积 较大的动物生殖细胞，它的低温保存技术是人类辅助生殖领域的重要工具。通过对健康的卵母细胞进行低温保存，将能够为需要的人提供更多的生育机会。在低温保存过程中不可避免的要使用低温保护剂，低温保护剂的使用也会带来许多副作用:一方面低温保护剂添加和去除过程中，由于渗透压的急剧变化，大量水或低温保护剂快速流出或流入细胞，从而引起细胞体积的膨胀或收缩，造成细胞膜结构和细胞骨架系统的损伤；另一方面低温保护剂对细胞有化学毒性损伤，并且其毒性大小随作用时间和作用浓度的增加而增大。目前通常采用分步添加和分步去除保护剂的方法。这种方法操作步骤繁琐，要求在很短的时间内在显微镜下准确找到细胞，并完成细胞在溶液间的转移，非常容易造成细胞的丢失，对操作人员的熟练程度要求很高；而且分步添加和分步去除的次数也不可能增加太多，这就使卵母细胞仍然会受到几次由于保护剂浓度突然变化造成的体积突然变化，且在高浓度低温保护剂中的暴露时间长。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片。
[0005]本发明的目的之二是提供一种将微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用方法。
[0006]本发明的技术方案:一种微流体细胞处理芯片，由底层和顶层构成，其特点是:顶层中设有蛇形管道和细胞操作腔、蛇形管道的溶液流入口上设有两个流入通道，两个流入通道的入口管道上分别设有保护剂入口和缓冲溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道连接细胞操作腔，细胞操作腔设有溶液出口和细胞进出口通道，细胞进出口通道上装有转矩控制微阀，细胞操作腔的两侧各设有一个半隔断。
[0007]保护剂入口和缓冲溶液入口对称于蛇形管道的溶液流入口，保护剂入口和缓冲溶液入口的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管与一个双通道注射泵的两个注射器连接；入口管道的径高比为1:4-1:5。。
[0008]细胞操作腔为上凹的长方体，其容积为0.1-0.2mm3。
[0009]溶液出口连接第三微流体芯片毛细管，微流体芯片毛细管上设有溶液出口开关。
[0010]蛇形管道的横截面为正方形，其边长d=0.05、.2mm,相邻管道间距=0.2-0.3mm,蛇形管道的总长度为1.5-2.5cm。
[0011]半隔断为凸形扁平长方体，其与底层的间隙高度为30-40μm。
[0012]底层材质为玻璃基片，顶层材质为聚二甲基硅氧烷；细胞进出口通道上面设有半径4mm，深2mm的聚氨酯层，该聚氨酯层面积为所述顶层面积的0.3%~θ.5%，聚氨酯层中间连接转矩控制微阀。
[0013]由底层和顶层构成的所述芯片的长:宽:高=60~80:45-55:1~3。
[0014]一种微流体细胞处理芯片的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法:
低温保护剂加载方法的步骤为:
a)打开转矩控制微阀和溶液出口开关，用移液器将细胞及缓冲溶液注入与细胞进出通道入口连接的第二微流体芯片毛细管，将一注射器连接第二微流体芯片毛细管，推动注射器使得细胞进入细胞操作腔；
b)关闭转矩控制微阀，打开双通道注射泵中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，缓慢增加低温保护剂的流速，缓慢减小缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加；
c)在对细胞低温保护剂加载的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；
d)当细胞达到处理要求后，关闭两个注射器，打开转矩控制微阀，关闭溶液出口开关；
e)打开低温保护剂注射器，使得细胞从细胞操作腔经细胞进出通道冲出芯片，加载过程完毕。
[0015]低温保护剂去除的方法步骤为:
a)打开转矩控制微阀和溶液出口开关，用移液器将细胞及保护剂注入与细胞进出通道入口连接的第二微流体芯片毛细管，将一注射器连接第二微流体芯片毛细管，推动注射器使得细胞进入细胞操作腔；
b)关闭转矩控制微阀，打开双通道注射泵中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，缓慢减小低温保护剂的流速，缓慢增加缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续减小；
c)在对细胞低温保护剂去除的同时，用显微镜观察细胞体积的变化；
d)当细胞达到处理要求后，关闭两个注射器，打开转矩控制微阀，关闭溶液出口开关；
e)打开缓冲溶液注射器，使得细胞从细胞操作腔经细胞进出通道冲出芯片，去除过程完毕。
[0016]本发明的有益效果是:
本发明的微流体细胞处理芯片将微流体结构与细胞处理集成一种微型细胞处理、分析系统，该芯片可以在对体积较大的动物细胞冷冻保护剂加载或去除时，使保护剂浓度连续变化，具有操作直接简便、对细胞的损伤较小等优点。
[0017]本发明提供的一种将微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用，此应用方法克服了现有的体积较大的动物细胞，尤其是体积较大的动物生殖细胞低温保存过程中低温保护剂加载和去除方法的诸多缺点。
[0018]本发明的体积较大的动物细胞低温保护剂加载和去除的微流体方法是基于在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的微流体技术，保护剂溶液和缓冲溶液在微流体通道内以层流方式流动，两流体通过扩散方式混合，实现沿着通道方向保护剂浓度的连续改变，从而减小保护剂浓度的突然改变对细胞造成的渗透冲击以及细胞在高浓度保护剂中的毒性损伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明的微流体细胞处理芯片的顶层结构立体示意图；
图2是本发明微流体细胞处理芯片横截面示意图；
图3是本发明各管道通路连接示意图；
图4 Ca)是转矩控制微阀打开状态结构示意图；
图4 (b)是转矩控制微阀关闭状态结构示意图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
[0021]如图1至图3所示，本发明的微流体细胞处理芯片，由底层14和顶层15构成。该芯片本体与一个双通道注射泵通过微流体芯片毛细管连接，并加装在显微镜自动载物台上。
[0022]如图1，2所示，顶层15中设有蛇形管道6和细胞操作腔9，蛇形管道6的溶液流入口上设有两个连接有入口管道的流入通道2，两个流入通道2的入口管道上分别设有保护剂入口 4和缓冲溶液入口 5，蛇形管道6的溶液流出通道连接细胞操作腔9，细胞操作腔9设有溶液出口 11和细胞进出口通道7，细胞进出口通道7上装有转矩控制微阀8，细胞操作腔9的两侧各设有一个半隔断。
[0023]如图2所示，微流体芯片本体与注射泵通过第一微流体芯片毛细管13连接，该注射泵的型号为MFCS-3C (法国FLIGENT)；
芯片本体上表面设置的限定开口的保护剂入口 4和缓冲溶液入口 5，分别用于通入缓冲溶液和低温保护剂溶液；两个入口对称于蛇形管道6的溶液流入口，两个入口的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管13与一个双通道注射泵I的两个注射器连接；入口管道的径高比为1:4"!:5。
[0024]溶液出口 11处设置溶液出口开关12，该开关12位于与溶液出口 11相连接的第三微流体芯片毛细管18上，位于芯片之外；
两个溶液入口通过流入通道与蛇形管道6相连通，该蛇形管道6用于混合缓冲溶液与低温保护剂溶液，使混合溶液浓度连续变化；` 蛇形管道6在芯片内同一平面，蜿蜒蛇形，横截面为正方形，其边长d=0.05、.2mm,相邻管道间距=0.2-0.3mm，蛇形管道的总长度为1.5-2.5cm。
[0025]蛇形管道6的另一端连接有至少一个细胞操作腔9,细胞操作腔9为上凹的长方体，容积大小约为0.0.2mm3，腔的三面分别与蛇形通道6、细胞进出通道7和溶液出口 11相通。[0026]细胞操作腔9的两侧各设有一个半隔断10，该半隔断10为扁平的长方形，从上表面看去是下凸的，其与底层的间隙高度为30-40μπι，具有精确控制细胞的作用，由于其尺寸仅为卵母细胞直径的1/3，可保证细胞不被冲走，防止细胞在保护剂加载和去除过程中丢失;
芯片本体上还设置有一个细胞进出通道7，通过转矩控制微阀8的开闭来控制细胞进出细胞操作腔9。形成浓度连续变化的蛇形管道6、细胞操作腔9、细胞进出通道7、溶液出口 11直接相连通；
芯片本身的长:宽:高==6(T80:45~55:1-3，大小应该与带有自动载物台的显微镜载物台相匹配；
如图4 (a)所示，芯片本体主要分为两层:底层14材质为玻璃基片，顶层15材质为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)层；在PDMS层上表面设置有聚氨酯层16，该聚氨酯层16面积为所述PDMS层面积的0.3%~Ο.5% ；
在聚氨酯层中央位置装有转矩控制微阀8，该微阀8包含直径约为1_的螺丝钉，通过螺丝刀顺时针拧动螺钉，微阀8被关闭，逆时针旋转就能将微阀8打开；
为保证光线通过，微流体装置以SU-8 2000光刻胶制备模具，用透光率较好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)注塑成型；为增强微流体管道的亲水性，PDMS芯片需经过氧等离子体处理，处理后的芯片与玻璃基片键合制作完成微流体浓度连续变化细胞操作芯片。
[0027]微流体细胞处理芯片在卵母细胞低温保护剂加载和去除中的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法。
[0028]本发明在进行卵母细胞低温保护剂的加载应用方法的步骤如下:
1)将微流体细胞处理芯片安放固定在显微镜的自动载物台上；
2)打开转矩控制微阀8和溶液出口开关12，用移液器将卵母细胞及缓冲溶液注入与细胞进出通道7入口连接的第二微流体芯片毛细管17 ；
3)将一装有缓冲溶液的注射器连接微流体芯片毛细管17，推动注射器使得卵母细胞进入细胞操作腔9，溶液从细胞进出口通道7进入，经细胞操作腔9，从溶液出口 11流出；
4)调整显微镜聚光镜和物镜镜头，获得细胞操作腔9内卵母细胞的清晰图像；
5)拧紧转矩控制微阀8螺丝，关闭细胞进出通道7；
6)打开双通道注射泵I中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，两种溶液分别从相应入口进入芯片本体内的流入通道，然后在蛇形管道6中进行混合；低温保护剂的流量从O缓慢增加至50 μ 1/min,缓冲溶液的流量从50 μ 1/min缓慢减小至0，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加，控制两种流体的流速以实现保护剂浓度的连续变化，混合好的溶液经细胞操作腔9，从溶液出口 11流出；
7)当保护剂流量增至50μ 1/min,缓冲溶液的流量减至0，即可认为保护剂加载完毕(不同细胞和不同浓度的低温保护剂，加载方案不同)，关闭两个注射器，打开转矩控制微阀8，关闭溶液出口 12 ；
8)打开双通道注射泵I中的低温保护剂注射器，使得细胞从细胞操作腔9经细胞进出通道7，从与细胞进出口通道7相连接的第二微流体芯片毛细管17流出；冲出的细胞放在cryotop片上投入液氮,进行低温保存。
[0029]本发明进行卵母细胞低温保护剂的去除应用方法的步骤如下:1)将微流体细胞处理芯片安放固定在显微镜的自动载物台上；
2)打开转矩控制微阀8，见图4Ca)和溶液出口开关12，用移液器将卵母细胞及解冻液{基础液[组织培养液(TCM) 199 + 20%胎牛血清(FBS)]+0.5 mol/L蔗糖}注入与细胞进出通道7入口连接的第二微流体芯片毛细管17 ；
3)将一装有解冻液的注射器连接第二微流体芯片毛细管17，推动注射器使得卵母细胞进入细胞操作腔9 ；
4)调整显微镜聚光镜3和物镜镜头，获得细胞操作腔9内卵母细胞的清晰图像；
5)拧紧转矩控制微阀8螺丝，见图4(b)，关闭细胞进出通道7 ；
6)打开双通道注射泵I中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，两种溶液分别从相应入口进入芯片本体内的流入通道，然后在蛇形管道6中进行混合；低温保护剂的流量从50 μ 1/min缓慢减小至0，缓冲溶液的流量从O缓慢增加至50 μ 1/min,使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续减小，控制流速以实现保护剂浓度的连续变化，混合好的溶液经细胞操作腔9，从溶液出口 11流出； 7)当缓冲溶液的流量增至50μ 1/min，保护剂流量减至0，即可认为保护剂去除完毕(不同细胞和不同浓度的低温保护剂，加载方案不同)，关闭两个注射器，打开转矩控制微阀8，关闭溶液出口 12 ；
8)打开双通道注射泵I中的缓冲溶液注射器，使得细胞从细胞操作腔9经细胞进出通道7冲出芯片。
[0030]最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种微流体细胞处理芯片，由底层(14)和顶层(15)构成，其特征在于:所述顶层(15 )中设有蛇形管道(6 )和细胞操作腔(9 )，蛇形管道(6 )的溶液流入口上设有两个流入通道(2)，两个流入通道(2)的入口管道上分别设有保护剂入口(4)和缓冲溶液入口( 5)，蛇形管道(6 )的溶液流出通道连接细胞操作腔(9 )，细胞操作腔(9 )设有溶液出口( 11)和细胞进出口通道(7 )，细胞进出口通道(7 )上装有转矩控制微阀(8 )，所述细胞操作腔(9 )的两侧各设有一个半隔断(10)。
2.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述保护剂入口(4)和缓冲溶液入口(5)对称于蛇形管道(6)的溶液流入口，保护剂入口(4)和缓冲溶液入口(5)的开口直径相同；并且分别通过第一微流体芯片毛细管(13)与一个双通道注射泵(I)的两个注射器连接；所述入口管道的径高比为1:41:5。
3.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述细胞操作腔(9)为上凹的长方体，其容积为0.1-0.2mm3。
4.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述溶液出口(11)连接第三微流体芯片毛细管(18)，第三微流体芯片毛细管(18)上设有溶液出口开关(12)。
5.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述蛇形管道(6)的横截面为正方形，其边长d=0.05-0.2mm，相邻管道间距=0.2~0.3mm，总长度为1.5~2.5cm。
6.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述半隔断(10)为凸形扁平长方体，其与底层的间隙高度为30-40μπι。
7.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:所述底层(14)材质为玻璃基片，顶层(15)材质为聚二甲基硅氧烷；细胞进出口通道(7)上面设有半径4mm，深2mm的聚氨酯层(16)，所述聚氨酯层(16)面积为所述顶层面积的0.3%~Ο.5%，聚氨酯层中间连接转矩控制微阀(8)。
8.根据权利要求1所述的微流体细胞处理芯片，其特征在于:由底层(14)和顶层(15)构成的所述芯片的长:宽:高=60~80:45-55:1~3。
9.一种权利要求1至8任一项所述的微流体细胞处理芯片的应用方法，包括低温保护剂加载方法和低温保护剂去除的方法，其特征在于: 所述低温保护剂加载方法的步骤为: a)打开转矩控制微阀(8)和溶液出口开关(12)，用移液器将细胞及缓冲溶液注入与细胞进出通道入口(7)连接的第二微流体芯片毛细管(17)，将一注射器连接第二微流体芯片毛细管(17)，推动注射器使得细胞进入细胞操作腔(9); b)关闭转矩控制微阀(8)，打开双通道注射泵(I)中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，缓慢增加低温保护剂的流速，缓慢减小缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加； c)在对细胞低温保护剂加载的同时，用显微镜观察细胞体积的变化； d)当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵(I)中的两个注射器，打开转矩控制微阀(8)，关闭溶液出口开关(12); e)打开低温保护剂注射器，使得细胞从细胞操作腔经细胞进出通道(7)冲出芯片，加载过程完毕； 所述低温保护剂去除的方法步骤为:a)打开转矩控制微阀(8)和溶液出口开关(12)，用移液器将细胞及保护剂注入与细胞进出通道(7)入口连接的第二微流体芯片毛细管(17)，将一注射器连接第二微流体芯片毛细管(17)，推动注射器使得细胞进入细胞操作腔(9)； b)关闭转矩控制微阀(8)，打开双通道注射泵(I)中的低温保护剂注射器和缓冲溶液注射器，缓慢减小低温保护剂的流速，缓慢增加缓冲溶液的流速，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续减小； c)在对细胞低温保护剂去除的同时，用显微镜观察细胞体积的变化； d)当细胞达到处理要求后，关闭双通道注射泵(I)中的两个注射器，打开转矩控制微阀(8)，关闭溶液出口开关(12)； e)打开缓冲溶液注射器，使得细胞从细胞操作腔(9)经细胞进出通道(7)冲出芯片，去除过程完 毕。
【文档编号】C12M1/00GK103451090SQ201310425428
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】周新丽, 周楠峰, 杨云, 李维杰 申请人:上海理工大学