包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶及制备方法。该包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，粒径为3-4mm，在明胶核上包覆有氧化硅膜层。其制备方法过程包括：配制明胶及含有醇脱氢酶混合溶液；配制硅酸钠及戊二醛溶液前驱体混合溶液；将明胶及醇脱氢酶酶的混合溶液逐滴加入到0～4℃的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，再经搅拌孵化得到包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶。本发明的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，所得包埋醇脱氢酶的杂化明胶-氧化硅凝胶具有固定能力强，与明胶凝胶相比固定化醇脱氢酶酶的泄漏率低，与明胶凝胶相比本发明溶胀度低，重复使用稳定性好。
【专利说明】包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶及制备方法，属于酶的固定化技术。
【背景技术】
[0002]明胶凝胶是一种常用的固定化酶载体。目前，明胶凝胶固定化酶主要采用包埋法。包埋法条件温和，生物相容性好，有利于维持酶的结构完整性，进而提高酶的活性维持率，而且载体孔径较大，有利于反应物和产物传递。
[0003]明胶凝胶固定化酶通常存在的问题是载体的孔径较大，酶分子容易泄漏。凝胶易溶胀，机械强度差，循环使用稳定性和储存稳定性不高。解决问题的方法通常是利用双功能基团交联剂如戊二醛等进行交联，使凝胶载体更加致密，或是在凝胶外表面构造无机壳层，制备有机一无机杂化凝胶。
[0004]氧化硅是有机一无机杂化材料中常见的无机组分，用于制备杂化载体可以提高凝胶的机械性能，同时抑制酶分子的泄露，提高酶对温度、PH变化的耐受性，同时提高储存和循环使用稳定性。仿生硅化为二氧化硅材料的制备提供了一条新途径，仿生硅化过程避免了酸碱催化剂的使用，制备简单，所用原料均具有很好的生物相容性，适用范围广。
[0005]利用明胶仿生硅化过程制备包埋醇脱氢酶的明胶一氧化硅杂化载体用于固定化酶具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶及制备和方法。以该方法所制得的包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶尺寸均一，方法简单，包埋醇脱氢酶的泄漏率低，载体溶胀度低，重复使用性好。
[0007]本发明是通过下述技术方加以实现的，一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，其特征在于，该包埋醇脱氢酶的杂化凝胶为粒径3-4_，其中在明胶核上包覆有厚度为10-20 μ m的氧化硅膜层，其中一毫升杂化凝胶包埋醇脱氢酶含量为I~4mg。
[0008]上述结构的包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶制备方法，其特征在于包括以下过程:
(1)配制质量浓度为15~25%的明胶溶液，向该明胶溶液中加入醇脱氢酶配制成含有醇脱氢酶浓度为I~4mg/mL的混合溶液；
(2)配制浓度40~80mM的硅酸钠前驱体溶液，用盐酸调节硅酸钠溶液的pH值为6.5~8，按硅酸钠溶液与质量分数50%戊二醛溶液二者的体积比为1:0.1~0.25，将戊二醛溶液加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液；
(3)用注射器将步骤(1)的混合溶液逐滴加入到O~4°C的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤，将明胶颗粒浸入步骤(2)制备好的前驱体混合溶液中，搅拌孵化25~35分钟后得到包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅凝胶。[0009]本发明的优点在于:制备条件温和，制备工艺简单易行，所得包埋醇脱氢酶的杂化明胶-氧化硅凝胶具有固定能力强，与明胶凝胶相比固定化醇脱氢酶酶的泄漏率低，本发明泄漏率为5%，明胶凝胶泄漏率为83.6%，与明胶凝胶相比本发明溶胀度低，溶胀度为
7.9%，明胶凝胶的溶胀度为120%，重复使用稳定性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例一制备的包埋醇脱氢酶明胶一氧化硅杂化凝胶颗粒表面扫描电镜(SEM)照片。
[0011]图2为本发明实施例二制备的包埋醇脱氢酶明胶一氧化硅杂化凝胶颗粒断面扫描电镜(SEM)照片。
[0012]图3为本发明实施例四制备的包埋醇脱氢酶明胶一氧化硅杂化凝胶与明胶凝胶的泄漏率变化图。
[0013]图4为采用本发明实施例五制备的包埋醇脱氢酶明胶一氧化硅杂化凝胶与明胶凝胶的溶胀度变化图。
[0014]图5为采用本发明实施例四制备的包埋醇脱氢酶明胶一氧化硅杂化凝胶固定的醇脱氢酶的循环使用活力的变化图。
【具体实施方式】
[0015]实施例一
将706mg明胶溶于4mL的去离子水中，配制成质量分数为15%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入4mg醇脱氢酶,搅拌,混合均匀，配制20 mL浓度为40mM的娃酸钠前驱体溶液，用浓盐酸调节硅酸钠溶液的P`H值为6.5，取质量分数50%戊二醛溶液40 μ L加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液，然后用注射器将明胶与醇脱氢酶的混合溶液逐滴滴加到0°C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒加入配制得硅酸钠前驱体混合溶液，孵化25分钟，制得包埋醇脱氢酶明胶-氧化硅杂化凝胶。
[0016]对上述过程制得的明胶-氧化硅杂化凝胶进行循环使用稳定性的测定:
将甲醛和还原型辅酶I 二钠加到0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，
配成甲醛浓度为IOmM，还原型辅酶I 二钠浓度为133 μ M，加入制备的固定化醇脱氢酶的杂化凝胶颗粒，在25°C，搅拌的条件下进行甲醛的转化反应，用紫外分光光度计测定还原型辅酶I 二钠的转化量，得到固定化醇脱氢酶的酶活力，并以此酶活力为初始酶活力，定义为100%。
[0017]将反应液过滤，用去离子水清洗颗粒至上清液中无甲醛和原型辅酶I 二钠。重复上述反应过程，得到第二次重复使用的固定化醇脱氢酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为90.3%。
[0018]重复分离和反应过程，得到第三次重复使用的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为84% ;第四次重复使用的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为75.7% ;第五次重复使用的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为66.5% ;第六次重复使用的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为59.5%。[0019]实施例二
将Ig明胶溶于3mL的去离子水中，配制成质量分数为25%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入12mg醇脱氢酶，搅拌，混合均匀，配制20 mL浓度为80mM的硅酸钠前驱体溶液，用浓盐酸调节硅酸钠溶液的PH值为8，取质量分数50%戊二醛溶液100 μ L戊二醛加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液，然后用注射器将明胶与醇脱氢酶的混合溶液逐滴滴加到4°C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒加入配制得硅酸钠前驱体混合溶液，孵化35分钟，制得包埋醇脱氢酶明胶-氧化硅杂化凝胶。
[0020]实施例三
将Ig明胶溶于3mL的去离子水中，配制成质量分数为25%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入12mg醇脱氢酶，使其浓度为4mg/mL,搅拌,混合均匀，配制20 mL浓度为50mM的硅酸钠前驱体溶液，用浓盐酸调节硅酸钠溶液的pH值为7.0，取质量分数50%戊二醛溶液使40 μ L戊二醛加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液，然后用注射器将明胶与醇脱氢酶的混合溶液逐滴滴加到4 °C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒加入配制得硅酸钠前驱体混合溶液，孵化30分钟，制得了包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，将包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶浸泡于PH为7三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，在前三个小时内测得溶液中无醇脱氢酶的泄漏，泄漏率为O,十个小时后泄漏率为5%。
[0021]实施例四
将706mg明胶溶于4mL的去离子水中，配制成质量分数为15%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入4mg醇脱氢酶, 使其浓度为lmg/mL,搅拌,混合均匀，配制20 mL浓度为50mM的硅酸钠前驱体溶液，用浓盐酸调节硅酸钠溶液的pH值为7.0，取质量分数50%戊二醛溶液40 μ L戊二醛加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液，然后用注射器将明胶与醇脱氢酶的混合溶液逐滴滴加到O °C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒加入配制得硅酸钠前驱体混合溶液，孵化30分钟，制得了包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，将该杂化凝胶浸泡于PH为7三羟甲基氨基甲烷-盐酸的缓冲溶液中，室温下存放30个小时，称量杂化凝胶颗粒质量变化，计算出溶胀度为7.9%。
[0022]对比例一
将Ig明胶溶于3mL的去离子水中，配制成质量分数为25%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入12mg醇脱氢酶，使其浓度为4mg/mL,搅拌,混合均匀,然后注射器将明胶与醇脱氢酶混合溶液逐滴滴加到4 °C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶的凝胶颗粒浸泡于PH为7三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中5h，测定溶液中醇脱氢酶含量，得到明胶凝胶存放过程中醇脱氢酶的泄漏率为83.6%
对比例二
将706mg明胶溶于4mL的去离子水中，配制成质量分数为15%的明胶溶液，向上述明胶溶液中加入4mg醇脱氢酶,使其浓度为lmg/mL,搅拌,混合均匀，然后注射器将明胶与醇脱氢酶混合溶液逐滴滴加到O °C去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤，用去离子水洗涤三次后，将包埋醇脱氢酶的凝胶颗粒浸泡于PH为7三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，室温下存放30个小时，称量明胶凝胶颗粒质量变化，计算出溶胀度为120%。
【权利要求】
1.一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，其特征在于，该包埋醇脱氢酶的杂化凝胶为粒径3-4mm，其中在明胶核上包覆有厚度为10-20 μ m的氧化硅膜层，其中一毫升杂化凝胶包埋醇脱氢酶含量为I~4mg。
2.一种按权利要求1所述的包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶制备方法，其特征在于包括以下过程: (1)配制质量浓度为15~25%的明胶溶液，向该明胶溶液中加入醇脱氢酶配制成含有醇脱氢酶浓度为I~4mg/mL的混合溶液； (2)配制浓度40~80mM的硅酸钠前驱体溶液，用盐酸调节硅酸钠溶液的pH值为6.5~.8，按硅酸钠溶液与质量分数50%戊二醛溶液二者的体积比为1:0.1~0.25，将戊二醛溶液加入硅酸钠溶液，得到前驱体混合溶液； (3)用注射器将步骤(I)的混合溶液逐滴加入到O~4°C的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，过滤后，用去离子水洗涤，将明胶颗粒浸入步骤(2)制备好的前驱体混合溶液中，搅拌孵化25~35分钟.后得到包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶。
【文档编号】C12N11/14GK103468669SQ201310425486
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】吴洪, 宋晓凯, 姜忠义, 王晓莉 申请人:天津大学