非人哺乳动物神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途。本发明的小鼠模型与人类的神经精神疾病高度相似。基于该模型动物的神经精神疾病药物筛选平台，可用于筛选新药以及开发其他治疗方法。
【专利说明】非人晡乳动物神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】。更具体地说，本发明涉及一种非人哺乳动物的神经精 神疾病动物模型及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 精神分裂症（Schizophrenia)是一类最常见精神疾病，影响全世界人口的 0. 5%_1%，以基本个性改变，思维、情感和行为的分裂，精神活动与环境不协调为主要特征。 该病在男性中多发生于青春期晚期至25岁，在女性中25-35岁是高发期，自然病程多迁延， 多数呈复发和加重，慢性化和衰退的过程，且与其他精神疾病遗传关联性强，重叠率高，最 终结局约一半左右患者出现精神残疾并伴随1?自杀率。
[0003] 精神分裂症是一种人类复杂疾病，尽管目前对其病因的认识尚不很明确，但个体 的易感素质和外部环境的不良因素对疾病的发生发展的作用已被大家所共识。多项研 究表明，精神分裂症是在基因与环境相互作用的基础上发生的，但遗传因素在精神分裂 症的发生中具有重要作用，其遗传度高达〇? 70?0.85(Picchioni，M.M.，andMurray，R. M. (2007). Schizophrenia. Bmj335, 91-95.)。但其遗传方式不符合经典的孟德尔遗传规 律，具有多基因高异质性遗传特征（McGuffin，P.，and Owen, M. (1991).The molecular genetics of schizophrenia:an overview and forward view. European archives of psychiatry and clinical neuroscience240, 169-173.)。精神分裂症的发生还与环境因 素有关，通常认为在个体具有遗传易感性背景的基础上，环境有害因素作用于机体可导致 疾病的发生。
[0004] 精神分裂症的发病机制没有统一定论，各种假说一直处于争论与变化之中。目 前有4种学说：神经递质紊乱学说、神经发育障碍学说、神经细胞膜学说和免疫系统障碍 学说，但是，迄今为止并无任何一种假说能够十分恰当地阐明精神分裂症的发病机制并 被精神医学界广泛接受（Keshavan, M. S.，Tandon, R.，Boutros, N. N.，and Nasral lah, H. A. (2008) ? Schizophrenia, 〃just the facts〃：what we know in2008Part3:neurobiology. Schizophrenia researchl06, 89-107. )〇
[0005] 人类行为的基因控制和小鼠或其他动物模型的行为基因控制有相似性。比如，大 多数啮齿类动物焦虑的形式和人类的突发焦虑症类似；人类抑郁症与啮齿类动物行为表现 是压力诱导的逃避减弱；模拟精神分裂症啮齿类动物模型可以表现为运动活动性增加、精 神兴奋、紧张性刺激、社交退缩、及对多巴胺拮抗剂的应答的抑制和惊反射中弱刺激的抑制 作用减弱。所以人类疾病的动物模型为人类深入了解和认识疾病提供了有力的工具。
[0006] 目前建立精神分裂症的动物模型主要有四种方式，第一种发育造模，包括营养缺 乏、隔离饲养和免疫刺激等；第二种药物诱导，包括各种类型的受体激动剂和拮抗剂，常用 的有苯环己哌啶（PCP)、MK801和可他命；第三种是基因修饰，包括基因敲除、基因敲入、转 基因和突变；第四种是损毁造模，主要是损毁腹侧海马和前额叶（Jones，C. A.，Watson，D. J. , and Fone, K.C. (2011). Animal models of schizophrenia. British journal of pharmacology164, 1162-1194.) 〇
[0007] 目前已提出的精神分裂症的重要候选基因包括G蛋白信号调节子4(RGS4)， dysbindin(DTNBPl)，神经调节素 l(neuregulin_l，NRG1), G72,儿茶酌?-〇-甲基转移酶 (C0MT)，精神分裂症断裂基因l(DISCl)和代谢型谷氨酸受体3(GRM3,也被称为mGluR3)等。 然而，由于精神分裂症等疾病的成因复杂，因此迄今为止，对所谓的"精神分裂症的重要候 选基因"进行导入或敲除等操作，尚未获得令人满意的神经精神疾病动物模型。
[0008] 因此，本领域迫切需要开发非人哺乳动物神经精神疾病动物模型。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的就是提供一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型，及其制备方 法和用途。
[0010] 在第一方面，本发明提供了一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型的制备方 法，该方法包括以下步骤：
[0011] ⑴提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因 失活的细胞；
[0012] (2)利用步骤⑴中得到的CRMP2基因失活的细胞，制备得到CRMP2基因失活的神 经精神疾病动物模型。
[0013] 在另一优选例中，所述将CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。
[0014] 在另一优选例中，所述基因失活包括CRMP2基因不表达，或表达没有活性的CRMP2 蛋白。
[0015] 在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、 大鼠、兔、猴。
[0016] 在另一优选例中，所述方法包括：
[0017] (1)利用DNA同源重组技术，将所述CRMP2基因中的外显子1至外显子14中一个 或多个外显子剔除或中断，并任选地用筛选标记替换，得到CRMP2基因失活的非人哺乳动 物细胞；
[0018] (2)利用步骤（1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非 人哺乳动物；
[0019] (3)将步骤（2)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁 育，在后代中筛选获得CRMP2基因失活的杂合子非人哺乳动物；
[0020] (4)通过将步骤（3)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得CRMP2基因失活 的纯合子非人哺乳动物，从而得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型。
[0021] 在另一优选例中，所述CRMP2基因失活是通过缺失或敲除CRMP2的外显子3而失 活。
[0022] 在另一优选例中，所述的CRMP2基因失活是大脑特异性的CRMP2基因失活或全身 的CRMP2基因失活。
[0023] 在另一优选例中，所述的方法还包括步骤（5):将CRMP2基因失活的纯合子非人哺 乳动物与同一物种的神经特异性敲除工具非人哺乳动物进行杂交，从而获得大脑特异性的 CRMP2基因失活的非人哺乳动物动物模型。
[0024] 在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤（5)中把CRMP2flox/ flox小鼠与工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+ ;Nestin_Cre小鼠。再把 CRMP2flox/+ ;Nestin-Cre小鼠与CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神经前体细胞特异 性CRMP2基因的敲除小鼠简称cKO小鼠（即大脑特异性CRMP2失活小鼠）。
[0025] 在另一优选例中，所述筛选标记为neo基因。
[0026] 在另一优选例中，所述步骤（2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型中， 与野生型对照动物相比，具有以下一个或或多个特征：
[0027] 自发活动水平增加；
[0028] 抑郁样的行为增加；
[0029] 空间学习和记忆能力受损；
[0030] 表现出孤独症样和精神分裂症样行为；
[0031] 海马区突触后致密组分中部分受体亚基的含量减少；
[0032] 长时程增强受损；和/或
[0033] 成年新生神经元发生减少。
[0034] 在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型 的用途，将该模型用作研究神经精神疾病的动物模型。
[0035] 在另一优选例中，所述神经精神疾病包括：精神分裂症、躁郁症、重度抑郁症、孤独 症、和/或老年痴呆症。
[0036] 在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型 的用途，其中，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经精神疾病的物质（治疗剂）。
[0037] 在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型 的用途，所述的神经精神疾病是成年新生神经元发生减少相关疾病。
[0038] 在另一优选例中，所述的成年新生神经元发生减少相关疾病是精神分裂症、躁郁 症、抑郁症、孤独症、和/或老年痴呆症。
[0039] 在本发明的第五方面，提供了用本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模 型。
[0040] 在另一优选例中，对于CRMP2基因失活而言，所述的非人哺乳动物模型是杂合的 或纯合的。
[0041] 在另一优选例中，所述的CRMP2基因失活是大脑特异性的CRMP2基因失活或全身 的CRMP2基因失活。
[0042] 在本发明的第六方面，提供了一种筛选或鉴定治疗或缓解神经精神疾病的潜在治 疗剂的方法，包括以下步骤：
[0043] a.将候选物质施用于本发明第五方面所述的非人哺乳动物模型；和
[0044] b.对所述动物模型的行为进行行为学分析，并与对照组进行比较；
[0045] 其中，与对照相比，如果施用了候选物质的动物模型中表征神经精神疾病行为得 到改善，则表明该候选物质是神经精神疾病的潜在治疗剂。
[0046] 在另一优选例中，所述的行为学分析包括：开放场实验、高架十字迷宫实验、强迫 游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验、水迷宫实验、关联/暗示条件恐惧实验、惊反射前脉冲 抑制实验、筑巢实验、或其组合。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1显示了本发明一个实施例中的CRMP2基因打靶载体构建策略。
[0049] 图2显示了 Pop Out载体的示意图
[0050] 图3显示了 CRMP2基因打靶载体及多酶切鉴定。
[0051] 图4显示了 ES细胞筛选loxP位点、3'端和5'端PCR鉴定结果示意图。
[0052] 图5显示了 . CRMP2嵌合体小鼠。
[0053] 图6显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠繁殖策略。
[0054] 图7显示了大脑特异性CRMP2敲除效率验证结果。其中，（A)CRMP2基因敲除小鼠 基因型鉴定图示；(B)CRMP2基因敲除小鼠海马中CRMP2的mRNA的表达水平有显著下调， CRMPs家族的其他成员mRNA表达水平没有明显变化；（C)免疫印迹法检测显示CRMP2cK0小 鼠各个脑区的CRMP2及P-CRMP2蛋白表达水平明显降低；(D)免疫荧光染色检测CRMP2在 cKO小鼠脑片上明显降低。注 ：0B，嗅球；Cor，皮层；Cere，小脑；Hip，海马；Med，髓质；标 尺：200 u m。
[0055] 图8显示了敲除CRMP2可使小鼠体重下降，但皮层分层基本正常。其中，（A)P56 小鼠体重的定量分析（雌鼠：对照组n=13，cK0 n=8雄鼠：对照组n=13，cK0 n=8) ;(B)出生 56天的对照小鼠和CRMP2cK0小鼠（nestin-cre)的大脑形态（比例尺2mm) ;(C)尼氏染色 示出生56天的对照小鼠和CRMP2cK0小鼠大脑结构没有明显异常；(D) NeuN染色显示CRMP2 特异敲除小鼠出生56天后皮层各层分布未见明显异常。注：所有数据均为平均值土平均 值的标准差（土 SEM) ;t 检验，#p〈0. 01，*p〈0. 05
[0056] 图9显示了 CRMP2敲除小鼠神经元迁移正常。其中，图A_D : TBR1，SATB2, FoxPl，CTIP2染色显示E18. 5的CRMP2,表明cKO鼠脑中皮层各层并未出现明 显的缺陷及异常。
[0057] 图10显示了 CRMP2神经特异敲除小鼠自发活动增加但是焦虑样行为正常。其中， (A)旷场实验中小鼠在30分钟内的活动总距离；(B)旷场实验中小鼠在30分钟内停留在中 央区域的时间比例；(C)高架十字迷宫实验中小鼠在5分钟的测试时间内停留在开臂区域 的时间占总时间的比例。
[0058] 图11显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠抑郁样行为增加。其中，（A)强迫游泳实 验，每6分钟为一测试时段，累计小鼠不活动的时间；(B)悬尾实验，每6分钟为一测试时 段，累计小鼠不活动时间；(C)蔗糖偏好实验。比较小鼠对蔗糖溶液和水的偏好程度。
[0059] 图12显示了与孤独症非常类似的CRMP2敲除小鼠。
[0060] 图13显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠学习和空间记忆能力受损。其中，㈧场 景恐惧实验中小鼠在5分钟的测试时段内小鼠因恐惧而僵直的时间比例；(B)M 〇rriS水迷 宫实验，计算5天的训练周期中小鼠到达隐藏平台所需的平均时间；(C)空间探索实验第六 天小鼠停留在目标象限内的时间比例。
[0061] 图14显示了 CRMP2基因敲除小鼠表现出类精神分裂症行为。其中，（A)不同脉冲 强度下对照小鼠和CRMP2基因敲除小鼠的惊吓反应幅度；(B) CRMP2基因敲除小鼠前脉冲抑 制效应明显减弱；(C)对照组和CRMP2敲除小鼠做窝的图示；(D)CRMP2敲除小鼠在做窝评 分明显低于对照小鼠。
[0062] 图15显示了 CRMP2神经细胞特异敲除小鼠海马区突触后致密区受体量选择性下 降。其中，（A)免疫印迹显示分离的突触后致密区组分纯，同时表明突触后致密区组分中存在 CRMP2 ; (B)免疫印迹显示敲除小鼠突触后致密区组分中NMDA受体NR1和NR2B的量减少。
[0063] 图16显示了 CRMP2神经细胞特异敲除小鼠海马CA1区突触超微结构观察。其中， (A)电子显微例图显示对照小鼠和敲除典型的突触结构突触前囊泡（箭状标记）、突触后致 密组分（箭头）及树突棘（星号）；(B)CRMP2敲除小鼠的突触间隙与对照组没有差异；(C) CRMP2敲除小鼠在突触致密组分长度与对照组没有差异；(D)CRMP2敲除小鼠突触致密组分 面积较对照组小；(E)CRMP2敲除小鼠突触致密组分厚度比明显变薄；(F)通过累积频率图 及直方图分布和高斯曲线拟合的方式测绘突触后膜致密组分厚度。注：图B-E均为平均值 土 SEM。双尾T检验。
[0064] 图17显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠LTP受损。其中，（A)输入-输出曲线显 示CRMP2cK0小鼠的基础突触传导正常；(B)当间隔为60ms和500ms，对照和cKO小鼠双脉 冲易化比例相似；(C)CRMP2神经特异敲除小鼠TBS诱导的LTP明显减弱。
[0065] 图18显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠成年神经前体细胞增殖减少。其中，（A) Brdu免疫染色脑切片的共聚焦图示，比例尺：50 y m ; (B)齿状回区BrdU阳性细胞的体式学 定量分析；(C)活化的半胱天冬酶-3免疫染色脑切片的共聚焦图示，比例尺：50 y m ; (D)齿 状回颗粒下层及颗粒细胞层内活化的半胱天冬酶-3细胞密度的定量分析。
【具体实施方式】
[0066] 本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的神经精神疾 病模型，它是CRMP2基因被剔除或失活的小鼠或其他非人哺乳动物。本发明的动物模型是 一种有效的神经精神疾病动物模型，可用于研究精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症和老 年痴呆症等神经精神疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。在此基础上完成了本 发明。
[0067] 具体地，在本发明中，对大脑特异性CRMP2和全身敲除的小鼠模型的行为学检测 证实，该神经精神疾病模型动物的自发活动水平增加,抑郁样行为增加和精神分裂症样的 行为学表型，部分小鼠表现出典型的孤独症表型。对海马组织突触后膜致密组分中AMPA受 体亚基和NMDA受体亚基的免疫印迹分析表明敲除小鼠中海马PSD组分中NR1和NR2B的量 显著降低；通过透射电镜对海马CA1区放射层非对称突触的超微结构进行观察，发现敲除 小鼠在该区的PSD面积明显变小，厚度变薄；通过电生理技术发现敲除小鼠海马谢弗侧支 CA1区突触的基础传递和突触前膜的递质释放正常，但是TBS诱导产生的长时程增强却明 显受损。同时该基因敲除小鼠齿状回中成年神经干细胞增殖明显减少。
[0068] CRMP 家族和 CRMP2
[0069] CRMPs家族（CRMP1-5)的各个成员在不同的物种被独立发现，其中日本科学家 最早发现CRMP2在鸡胚的背根神经节中介导胞外信号Sema3A转导过程具有重要作用 (Goshima et al.，1995;Minturn et al.，1995)。在结构上，CRMP1-4 相互之间大约 75% 氨 基酸序列同源，但是CRMP5与其他成员只有50%-51%的氨基酸序列同源。CRMP1-4也与肝脏 中的二氢尿嘧啶脱氢酶序列高度同源而且结构与金属依赖的氨基水解酶高度相似，都能形 成稳定的四聚体（Hamajima et al.，1996)。但是CRMPs家族中没有一个成员具有酶活性，可 能是由于缺少氨基水解酶活化位点结合金属原子所必需关键氨基酸残基组氨酸（Wang and Strittmatter, 1996)〇
[0070] CRMP2(collapsin response mediator protein-2,也被称为 DPYSL2/ DRP2，Unc-33，Ulip或TUC2)是CRMPs家族的一员。CRMP2在神经元的极性建立上具有重要 作用，研究表明体外培养的海马神经元中过表达CRMP2促进多轴突形成，过表达功能缺失 突变体导致轴突变短（Inagaki et al.，2001)。CRMP2通过促进与微管蛋白异源二聚体结 合从而促进轴突的外向生长，而在神经突起的生长锥是通过调节极性蛋白Numb介导的内 吞作用来调控的神经元极性（Yoshimura et al.，2005)。CRMP2参与极性建立是通过磷酸 化与去磷酸化的方式调节与微管蛋白和Numb的亲和力来实现的。
[0071] CRMP2基因位于人类基因组8p22-p21上，全长150985bp (Genebank登录号： NG_030020. 1)。CRMP2的基因组序列包括13个内含子和14个外显子，有8个不同的转录 本，其中有三个转录本编码蛋白。这些序列信息可参见文献或Genebank等公共数据库。
[0072] 小鼠等其他物种的CRMP2基因也可参见文献或Genebank等公共数据库。
[0073] 应理解，术语"CRMP2"还包括各种天然存在的CRMP2基因的变异形式。代表性的 例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的CRMP2蛋白的核苷酸序列，编码野生 型CRMP2蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该 术语指CRMP2基因在该哺乳动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的CRMP2 (已知 小鼠CRMP2基因与人类CRMP2的cDNA同源度为86%，氨基酸序列的同源度为99%)。
[0074] 神经精神疾病及成年新生神经元发生（adult neurogenesis)减少相关疾病
[0075] 神经精神疾病是以表现在神经系统病变、行为、心理活动紊乱的一组疾病，主要分 为神经疾病与精神疾病。近年的研究表明，海马是与学习和记忆密切相关的脑区，从功能 上看，海马齿状回成年新生神经元发生对神经网络的可塑性和维持上具有重要的作用，也 是老年痴呆病早期阶段最容易受损的脑区，在精神分裂症与抑郁症等精神疾病病人中也 常伴有海马功能的异常。越来越多的证据提示海马齿状回区成年新生神经元发生（adult neurogenesis)的减少可能是精神分裂症与抑郁症等精神疾病及老年痴呆发病发病的重要 原因之一（Ming and Song, 2011 ;Winner et al.，2011 ;Mu and Gage, 2011)。
[0076] 在本发明中，成年新生神经元发生减少相关疾病包括但不限于情绪类疾病如精神 分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症，神经退行性疾病如老年痴呆、帕金森病等，优选地，包括精 神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症、和/或老年痴呆症。
[0077] 基因失活
[0078] 对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所 得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以 将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或 者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因 中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非 常强有力的手段。
[0079] 动物模型
[0080] 在本发明中，提供了一种非常有效的神经精神疾病的非人哺乳动物模型。
[0081] 在本发明中，非人哺乳动物的例子包括（但并不限于）：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳 地是大鼠和小鼠。
[0082] 如本文所用，术语"CRMP2基因失活"包括一个或两个CRMP2基因被失活的情况，即 包括CRMP2基因杂合地和纯合地失活。例如，CRMP2基因失活的小鼠可以是杂合或纯合的 小鼠。
[0083] 在本发明中，可基因剔除或转入外源基因（或片段）而使CRMP2基因失活等方法 制备CRMP2基因失活的非人哺乳动物（如小鼠）。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基 因而使靶基因失活的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。
[0084] 在本发明的另一优选例中，CRMP2基因的失活是通过基因剔除实现的。
[0085] 在本发明的另一优选例中，CRMP2基因的失活是通过CRMP2基因中插入外源基因 (或片段）而实现的。
[0086] 在本发明的一具体实例中，可构建一含有外源插入片段的构建物，该构建物含有 与靶基因（CRMP2)的插入位点的两侧的侧翼序列同源的同源臂，从而可以通过同源重组高 频地将外源插入片段（或基因）插入至CRMP2基因组序列（尤其是外显子区域），造成小鼠 CRMP2基因的移码、提前终止、或敲除，从而导致CRMP2缺失或失活。
[0087] 用本发明方法获得的纯合或杂合的小鼠可育，发育正常。失活的CRMP2基因可以 孟德尔规律遗传给后代小鼠。
[0088] 在一优选例中，本发明提供了一种缺失CRMP2基因的纯合小鼠模型动物。
[0089] 候选药物或治疗剂
[0090] 在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗神经精神疾病的候 选药物或治疗剂的方法。
[0091] 在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可 能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、化学合成的小分子或大分子化合 物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎 管给药或直接脑内注射。
[0092] 本发明的主要优点包括：
[0093] (a)本发明神经精神疾病模型的遗传稳定、表型稳定。
[0094] (b)用本发明方法获得的纯合或杂合的动物模型可育，发育正常。转基因杂合雄性 小鼠具有生殖能力，失活的CRMP2基因可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。
[0095] (c)所述神经精神疾病动物模型表现出多种神经和精神疾病样的症状，因此可以 广泛用于神经精神类疾病的药物筛选和测试，包括精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症和 老年痴呆等。
[0096] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0097] 材料
[0098] 1实验材料、主要试剂与实验仪器
[0099] 1. 1小鼠、细胞株、菌株和质粒
[0100] C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；ICR小鼠为中 国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心繁殖；工具鼠Nestin-Cre(品系名： B6.Cg(SJL)-TgN(Ne S-Cre)lKln)/J)购自南京大学模式动物研究所；Thyl-GFP-M由清华大 学左毅教授赠送。
[0101] ES细胞株（MPI-2,衍生自129SvJ品系）购自北京百奥赛图生物技术有限公司。
[0102] G418 抗性小鼠原代成纤维细胞（MEF)购自 National Cancer Institute at Frederic。
[0103] 大肠杆菌T0P10菌株（购自北京康为世纪生物技术有限公司）和工程菌EL350(购 自 National Cancer Institute at Frederic)〇
[0104] 质粒pBluescript II KS+购自Stratagen公司；打祀载体构建过程中使用的质粒 PL253，PL451，PL452 购自 National Cancer Institute at Frederic。含 CRMP2 基因全长 的 BAC 克隆（RPCI23-414A17)购自 Invitrogen 公司。
[0105] 1.2酶、培养基、试剂盒和生化药品
[0106] 所用的各种内切酶、Taq DNA Polymerase、T4DNA ligase、DNA Marker 购自 New England Biolab或Takara公司；基因型鉴定用的PCR mixture购自北京康为世纪生物科 技有限公司；DMEM，Trypsin，Pen-Str印为Hyclone产品；胰蛋白胨（LP0042)，酵母抽提粉 (LP0021)为0X0ID产品；DMS0购自Sigma公司；DNA回收纯化试剂盒购自索莱宝公司；质粒 小提试剂盒购自OMEGA公司；质粒中提，大提试剂盒购自Qiagen公司；寡核苷酸引物由上 海英骏生物技术有限公司合成。
[0107] 1. 3实验中使用的引物序列
[0108] 1. 3. 1扩增同源臂所用引物序列：
[0109]
【权利要求】
1. 一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型的制备方法，其特征在于，该方法包括 以下步骤： ⑴提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活 的细胞； (2)利用步骤（1)中得到的CRMP2基因失活的细胞，制备得到CRMP2基因失活的神经精 神疾病动物模型。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将CRMP2基因失活包括基因剔除、基 因中断或基因插入。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目 动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 利用DNA同源重组技术，将所述CRMP2基因中的外显子1至外显子14中一个或多 个外显子剔除或中断，并任选地用筛选标记替换，得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物细 胞； (2) 利用步骤（1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺 乳动物； (3) 将步骤（2)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育，在 后代中筛选获得CRMP2基因失活的杂合子非人哺乳动物； (4) 通过将步骤（3)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得CRMP2基因失活的纯 合子非人哺乳动物，从而得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述筛选标记为neo基因。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中得到的CRMP2基因失活的 非人哺乳动物模型中，与野生型对照动物相比，具有以下一个或或多个特征： 自发活动水平增加； 抑郁样的行为增加； 空间学习和记忆能力受损； 表现出孤独症样和精神分裂症样行为； 海马区突触后致密组分中部分受体亚基的含量减少； 长时程增强受损；和/或 成年新生神经元发生减少。
7. 根据权利要求1-6之任一项所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在 于，将该模型用作研究神经精神疾病的动物模型。
8. 根据权利要求1-6之任一项所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在 于，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经精神疾病的物质（治疗剂）。
9. 根据权利要求1-6之任一项所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在 于，所述的神经精神疾病是成年新生神经元发生减少相关疾病。
10. -种筛选或鉴定治疗或缓解神经精神疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括 以下步骤： a.将候选物质施用于权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型；和 b.对所述动物模型的行为进行行为学分析，并与对照组进行比较； 其中，与对照相比，如果施用了候选物质的动物模型中表征神经精神疾病行为得到改 善，则表明该候选物质是神经精神疾病的潜在治疗剂； 更佳地，所述的行为学分析包括：开放场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、悬尾 实验、蔗糖偏好实验、水迷宫实验、关联/暗示条件恐惧实验、惊反射前脉冲抑制实验、筑巢 实验、或其组合。
【文档编号】C12N15/09GK104450602SQ201310425687
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】许执恒 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所