检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的实时荧光定量PCR引物和探针以及使用其进行定量检测的方法，引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ?ID?No.3～SEQ?ID?No.8所示。本发明还提供了检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
【专利说明】检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属微生物检测领域，涉及检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒
【背景技术】
[0002]蜡样芽孢杆菌是一种需氧、中温、产芽孢的杆菌，是一种食品和化妆品中常见的污染菌。该菌在自然界广泛分布，几乎所有种类的食品都曾被报道与蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒有关。蜡样芽孢杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类，在亚洲以呕吐型为主，而在欧洲和北美地区则以腹泻型更为常见，除此之外还能引起其他一些非胃肠性感染。由于蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒症状通常较温和，且不超过24h，导致大量零星发生的蜡样芽孢杆菌食物中毒事件未被报道，蜡样芽孢杆菌感染数量大大被低估。而据挪威和荷兰系统监控的结果显示，蜡样芽孢杆菌是食品中最常检出的食源性致病菌(BeattieS H, Williams A G.Detection of toxins[M]//Encyclopedia of food microbiology.London:Academic Press, 2000:141-149.)。
[0003]呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒是其在食物中生长时产生的耐热呕吐毒素cereulide所致。Cereulide具有抗高温性，可耐受强酸强碱或胃蛋白酶。根据已知的非核糖体依赖的肽合成酶(NPRS)基序设计兼并引物扩增并测序得到蜡样芽孢杆菌呕吐毒素合成酶基因(简称ces基因)，且已证明在不产生cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株中检测不到 ces 基因(Ehling-Schulz M Vukov N Schulz A.1dentificationand partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase generesponsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus J.Appl EnvironMicrobiol.2005711105-113.)。
[0004]目前对蜡样芽孢杆菌的检测主要采用常规分离培养、生化检测方法，这些传统方法费时费力，需较长时间的选择性增菌培养过程，存在通量小或条件要求高等缺点，不适合大规模广泛应用。且因为cereulide的分子量很小，无抗原性，因此对呕吐毒素的检测极为困难，目前常用的是采用Hep-2细胞进行细胞培养分析和毒素导致精子运动能力下降的定性和半定量检测，缺乏一种快速可靠的检测方法。
[0005]近年来PCR技术等分子生物学方法开始应用于蜡样芽孢杆菌的快速检测。有文献报道基于SYBR Green I染料建立的实时荧光PCR方法，可实现对呕吐型蜡样芽孢杆菌的快速检测(王振国，刘金华，蔡阳等.应用实时荧光PCR检测致病性蜡样芽孢杆菌[J].生物技术通讯，2006，17(1):40-42)。但SYBR Green I染料除可与目标片段结合以外，还可以与引物二聚体等非特异性产物结合，因此检测时特异性较差，且无法进行多重实时荧光PCR检测。
`[0006]实时荧光PCR技术目前已广泛应用于多种微生物病原的快速检测中，如常见的食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌等。其原理为在核酸扩增反应中，探针与目的片段结合，基于Taq酶的5’至3’端外切酶活性，探针在扩增延伸阶段被水解，3’端荧光淬灭基团(Q)对5’端荧光报告基团(R)的抑制作用消失，荧光信号增强，从而进行目标核酸片段的检测。相比较于普通PCR，实时荧光PCR无需PCR后处理、有效避免PCR产物污染，且起点定量法比普通PCR方法的终点定量法更准确可靠。与SYBR Green I的实时荧
光PCR方法相比较，TaqMane探针法实时荧光PCR技术具有特异性更强、灵敏度更高的特
点，可在单管中实现多重检测，有利于高通量、自动化操作和联网管理等优势。由于蜡样芽孢杆菌有多种不同特性的基因，只针对一种基因做单一检测，极易造成漏检。在同一个反应体系里，同时对不同的靶基因进行扩增，能全方位地检测蜡样芽孢杆菌。多重检测与实时荧光PCR结合后，省去了核酸电泳的结果分析，进一步简化操作。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供和设计一套特异、敏感地检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的特异性引物和探针序列，并在这套序列的基础上建立一种基于实时荧光PCR的快速检测方法，提供一个呕吐型蜡样芽孢杆菌快速检测试剂盒，对蜡样杆菌进行种属鉴定的同时区分呕吐型蜡样芽孢杆菌。
[0008]为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物探针的技术方案。
[0009]1、筛选目标基因
[0010]根据以往的研究数据，对蜡样芽孢杆菌进行种属鉴定常用的基因有16S rRNA基因、16S rRNA与23S rRNA之间的间隔序列、groEL基因等。但应用这些基因检测时极易与苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、甚至韦氏芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、假真菌样芽孢杆菌等其他芽孢杆菌群发生交叉，出现假阳性`结果。使用gyrB基因作为诊断标记时，与其他致病菌均无交叉反应。因此，本发明采用gyrB基因设计特异性的引物探针序列，鉴定蜡样芽孢杆菌的种属。
[0011]呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒是其在食物中生长时产生的耐热呕吐毒素cereulide所致。在产生cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株中可检测到呕吐毒素合成酶基因(简称ces基因)，而在不产生cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株中检测不到ces基因。因此，ces基因是鉴定蜡样芽孢杆菌呕吐型的特征性基因，本发明还以ces基因为目标基因设计特异性的引物探针序列。
[0012]2、设计引物对和探针
[0013]本发明主要是通过检测gyrB基因和cesB基因，实现蜡样芽孢杆菌种属鉴定的同时检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的目的。
[0014]在对GenBank上查找gyrB种属鉴定基因和呕吐毒素cesB基因的核苷酸序列，将所有gyrB基因和cesB基因全长序列进行序列比对和分析,寻找gyrB基因和cesB基因各自核苷酸序列的特异性保守区，并针对各自的保守区分别设计gyrB基因和cesB基因的多
靶核苷酸引物对和TaqMane荧光探针。使用Primer Express3.0软件进行引物探针设计，
设计2-3套引物探针备用方案。引物和探针设计时要考虑到Tm值、GC含量，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体和错误引发等情况。
[0015]3、BLAST 分析[0016]在GenBank中对所有引物探针备用方案进行BLAST分析，获得特异性好的引物探针备用方案作为实验验证用方案。
[0017]4、PCR 验证
[0018]对每一个可用实验验证方案进行PCR验证，确定引物探针的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。
[0019]基于上述技术方案，本发明提供了用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的特异性引物，由特异性扩增gyrB基因和cesB基因的两对引物组成，其核苷酸序列如下:
[0020]特异性扩增gyrB基因的引物为:
[0021 ]上游引物 gyrB-F:ARTGACGATCRCGYCCTTG,
[0022]下游引物gyrB-R: CTTCKAAAGATCCAGCAATTAGTG。
[0023]特异性扩增ces基因的引物为:
[0024]上游引物cesB-F:TGGTTGCTTTGTTCTGCTGAAT,
[0025]下游引物cesB-R:CGCATTGCTAAATGGACTTACG。
[0026]进一步地，本发明还提供与所属引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基因Fam与Hex, 3’标记淬灭基因BHQl。
[0027]检测gyrB 基因的探针序列为 gyrB-P:Fam-ATCCACCSGCAGAGTCACCCTCTAC-BHQI。
[0028]检测cesB 基因的探针序列为 ces_P:Hex-TCTTCCTGAAGCGCCTCCCCATCTA-BHQI。
[0029]上述序列中的R、Y、K和S碱基为兼并碱基。
[0030]本发明还提供一种基于实时荧光PCR的呕吐型蜡样芽孢杆菌快速检测方法。以样品总DNA为模板，利用前述的引物和前述的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。该方法通过检测gyrB种属鉴定基因和cesB呕吐毒素基因片段，能够快速鉴定蜡样芽孢杆菌的同时，筛查呕吐型蜡样芽孢杆菌，其实现的技术方案如下:
[0031]1、引物探针合成
[0032]在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。
[0033]2、DNA模板准备
[0034]挑取呕吐型蜡样芽孢杆菌菌株，平板划线过夜培养。取单菌落，提总DNA，作为方法建立的模板。
[0035]3、构建和优化实时荧光PCR检测体系
[0036]在确定PCR反应体系中引物探针序列后，还需要从引物探针浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下:
[0037]5U/ μ L DNA 聚合酶卜2U，10XTaq Buffer With(NH4)2SO4 ( IOOmMTris-HCl (ρΗ8.8)，750mM (NH4)2SO4)2.5 μ L, IOmM dNTP0.5-1.5 μ L, 25mM MgCl22_5 μ L，引物探针混合物1.0 μ L，DNA模板2 μ L，超纯水补至25 μ L。
[0038]引物探针混合物的浓度配比见表I。
[0039]表I引物探针混合物成分配比表
[0040]
【权利要求】
1.一种用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物由检测gyrB基因和ces基因的两对引物组成； 所述检测gyrB基因的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.4所示； 所述检测ces基因的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.6所示。
2.与权利要求1所述引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列由SEQID N0.7,SEQ IDN0.8所示。
3.—种呕吐型蜡样芽孢杆菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果O
4.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:阳性对照、DNA聚合酶、反应体系缓冲液、Mg2+、dNTP和超纯水。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作反应体系为:5υ/μL DNA聚合酶1-2U, IOXTaq Buffer with (NH4)2SO4 (IOOmM Tris-HCl (pH8.8), 750mM (NH4)2SO4) 2.5 μ L,IOmM dNTP0.5-1.5 μ L, 25mM MgCl22_5 μ L，引物探针混合物 l.0yL, DNA 模板 2 μ L,超纯水补至25 μ L0
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为: 95°C预变性lOmin，I个循环；95°C变性15_30s，55_62°C退火延伸30-60s，40个循环；4°C保持。
【文档编号】C12Q1/04GK103451308SQ201310425587
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】王雷, 莫莎, 王晓艳, 张志强 申请人:北京卓诚惠生生物科技有限公司