十四种食源性致病菌多重pcr检测引物组和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种十四种食源性致病菌多重PCR检测引物组和试剂盒。其检测引物组由检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、嗜水气单胞菌和阳性内对照的引物对组成。本发明建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法，利用分析设计得到的所述引物对，对待测样品中提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有上述食源性致病菌。
【专利说明】十四种食源性致病菌多重PCR检测引物组和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属微生物检测领域，涉及十四种食源性致病菌多重快速PCR检测引物组和试剂盒。
【背景技术】
[0002]食源性致病微生物是引起食物中毒的重要生物学因素。随着国家对食品安全工作的重视，快速筛查食物中毒原因成为当务之急。本发明试剂盒的设计可用于筛查常见的引起腹泻的食源性微生物，它们包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌0157和嗜水气单胞菌，共十四种食源性致病微生物，检测样品来自于临床标本或者污染食物样本的增菌液。
[0003]本发明基于多重PCR原理，可在1-2个PCR反应中完成对上述十四种食源性致病菌的快速筛查，节约了操作时间和操作人力，极大地提高了食物中毒事件中实验室的检测能力。
[0004]目前，没有相似的试剂盒能做到同时筛查十四种常见食源性致病微生物，只能采用实时荧光PCR、普通PCR方法、免疫学方法(如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金法)对十四种致病微生物单个目标依次检测。这些单重检测方法共同的问题是缺少全套的可供使用的检测试剂以实现对十四种食源性致病微生物的筛查；使用单重检测方法逐个操作，配置反应体系数目多，要消耗大量的试剂、人力、物力和时间。免疫胶体金方法检测灵敏度和特异性较低。ELISA方法操作过程复杂，检测手段不够灵活，很难应对应急处置等场景的快速筛查。
[0005]与本发明相类似的检测方法有基`于液相芯片检测平台的多重PCR技术、基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术和基于arm-PCR原理的多重PCR技术等。这些技术与本发明的相同之处都采用了多重PCR技术，即在同一个反应体系内同时扩增多个目标片段，以达到节省时间、人力、试剂和样本的目标。
[0006]基于液相芯片检测平台的多重PCR技术、基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术均可以实现对多个检测目标的快速筛查，但目前基于这些技术均没有检测十四种食源性致病微生物的试剂盒研发成功。且基于液相芯片检测平台的多重PCR技术在一个PCR反应管中分两步进行PCR反应，第一轮PCR低浓度特异性引物设计导致PCR反应的灵敏度显著降低，从而影响整个检测试剂的灵敏度；多色微球标记检测PCR产物技术存在稳定性差的问题。且仪器的购置费用高，试剂耗材昂贵。
[0007]基于双探针杂交的multifinder多重PCR技术使用相邻的两个特异性探针杂交，提高检测特异性的同时影响了筛查的灵敏度，容易产生假阴性结果；该技术采用一代测序平台检测PCR产物，如ABI3130，ABI3500等，试剂耗材昂贵；检测过程经过核酸提取、双探针杂交、探针连接、PCR扩增、产物分析等步骤，操作比较繁琐，对操作人员的技术要求非常高，需要掌握一代测序平台的使用。[0008]基于arm-PCR原理的多重PCR技术，虽然解决了操作自动化和产物污染的问题，但是该技术投入较大，耗材昂贵。
【发明内容】
[0009]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种多重PCR检测十四种食源性致病菌的引物组和试剂盒，可快速筛查上述十四种食源性致病菌，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。
[0010]为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组:
[0011]1、构建阳性内对照(IAC)扩增引物和模板
[0012]以pET28a质粒为模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的I AC。I AC上游引物序列为5 ’ -TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3 ’，I AC下游引物的序列为5’ -TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a 的碱基序列如 SEQ ID N0.31 所示。
[0013]2、筛选不同细菌特异性的基因或者DNA片段用于引物设计
[0014]本发明通过文献分析和检测需求分析，获得了每一种致病菌候选扩增的基因或者DNA片段(见表1)。
[0015]表1十四种常见食源性致病菌多重PCR检测候选目标基因
[0016]
【权利要求】
1.一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组，其特征在于，其是由检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌0157和嗜水气单胞菌的引物对组成； 所述检测金黄色葡萄球菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.USEQID N0.2 所示； 所述检测大肠埃希氏菌0157引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 所示； 所述检测沙门氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.5, SEQ IDN0.6所示； 所述检测志贺氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8所示； 所述检测阪崎肠杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.9、SEQ IDN0.10所示； 所述检测霍乱弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.1U SEQ IDN0.12所示； 所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDN0.13、SEQ ID N0.14 所示； 所述检测结肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.15,SEQ IDN0.16所示；` 所述检测嗜水气单胞菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.17、SEQID N0.18 所示； 所述检测副溶血性弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.19、SEQID N0.20 所示； 所述检测蜡样芽孢杆菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.21、SEQID N0.22 所示； 所述检测大肠埃希氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.23、SEQID N0.24 所示； 所述检测单核细胞增生性李斯特氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID N0.25、SEQ ID N0.26 所示； 所述检测空肠弯曲菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.27,SEQ IDN0.28所示。
2.—种对14种食源性致病菌进行多重PCR检测的方法，其特征在于，将权利要求1所述引物组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有上述14种食源性致病菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.29和SEQ ID N0.30所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应按以下步骤进行:
(1)95°C 预变性 4min ； (2)95°C变性 15-60s，55-65°C退火 15_60s，72°C延伸 30_120s，共进行 30-40 个循环；
(3)72°C延伸 5-10min。
6.一种快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、阳性内对照引物对、阳性内对照模板、DNA聚合酶、反应体系缓冲液、Mg2+、dNTP、阳性对照和去离子水。`
【文档编号】C12N15/11GK103484546SQ201310425507
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】王雷, 王晓艳, 张志强 申请人:北京卓诚惠生生物科技有限公司