一种制备植物促根剂的方法
【专利摘要】一种制备植物促根剂的方法。属于生物【技术领域】。香菇多糖对动植物具有多种有益作用。采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过酸性液体培养基、珍珠岩固体培养基初步筛选耐酸菌丝突变体；经过多次酸性培养基继代培养和典型的拮抗测试复筛获得耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系；优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养；从发酵液收集滤液，经热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H202脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→Sephadex?G-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。这种方法可快速、低成本、大规模生产质量稳定的香菇多糖。
【专利说明】一种制备植物促根剂的方法
【技术领域】
[0001]一种制备植物根系促生剂的方法。该方法属于生物【技术领域】。采用这一技术，可以快速、大规模生产质量稳定的香菇多糖、并降低其生产成本。生产的根系促生剂能有效促进植物根系的旺盛生长，而对植物的其他器官影响较小，并且不受该物质高浓度的抑制，明显优于其他植物激素或生长调节剂。可以广泛应用于农林、食品和环境等领域。
【背景技术】
[0002]香菇多糖对动植物具有多种有益作用，一般采用从子实体中提取，生长周期长、分离成本高。因而，香菇多糖的生产和应用受到很大的限制。采用耐酸菌丝实施深层开放式培养大规模生产，以可以克服这些缺陷。
【发明内容】
[0003]采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过酸性液体培养基(pHl.0-4.0)、珍珠岩固体培养基初步筛选耐酸菌丝突变体；经过多次酸性培养基继代培养和典型的拮抗测试复筛获得耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系；优化培养工艺，在PH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养；从发酵液收集滤液，经热水浸提一香菇粗多糖一Sevag法脱蛋白一H202脱色一透析脱盐一DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析一Sephadex G-100柱层析一纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。这种方法可快速、低成本、大规模生产质量稳定的香菇多糖。
【具体实施方式】
[0004]I采用香菇子实体等来制备高活性菌丝
[0005]I)供试培养基
[0006](I)PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，pH自然。选择质量好的马铃薯洗净后，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分。切成小块(约1.0cmX 1.5cm至2.0cmX 3.0cm)。称取马铃薯200g，加水约1L，温火煮沸并保持30min，马铃薯块变软时用4层纱布过滤，滤汁内加入琼脂和葡萄糖，在文火上使琼脂融化，加水补足1L，分装后加琼脂经120°C高压湿热灭菌20min。
[0007](2)液体种子培养基(w / V):马铃薯20%，葡萄糖2 %，酵母浸粉0.5%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%,初始 ρΗ6.0。
[0008](3)摇瓶基础培养基(w / V):葡萄糖2 %，酵母浸粉0.5 %，KH2PO40.2 %，MgSO40.1%，初始 ρΗ2.5。
[0009]2)香菇菌丝培养
[0010]⑴菌种活化
[0011]将保存于试管斜面培养基上的香菇菌种用接种铲切出0.5cmX0.5cm大小的菌块接种于倒平板的PDA培养基上，25°C恒温培养6d。
[0012](2)液体种子培养
[0013]将已活化的斜面菌种切割成0.5cmX0.5cm大小菌块，接种于液体种子培养基中，每个250mL三角瓶接5块菌块，10个大小均一的玻璃珠，培养基装液量IOOmL,于25°C，150r / min培养6d,制备成发酵种子液。
[0014](3)摇瓶发酵培养
[0015]将摇瓶菌种在25°C静置24h后，用匀浆器将其匀浆。250mL三角瓶装培养基IOOmL,液体菌种接种量为10%，于25°C，150r / min培养12d。 [0016]3)菌种分离及纯化
[0017]香菇菌种分离就是把香菇菌丝体从混杂的微生物环境中单独分离出来，并进行纯培养。可采用孢子分离法和组织分离法。
[0018]孢子分离得到的菌丝具菌龄短，生活力强等优点，并具有双亲遗传特性，是选育高新菌株和杂交育种的材料，但由于其染菌率过高，因而，目前香菇生产上最常使用的I种分离方法为组织分离法。即就是利用香菇子实体组织，分离培养出香菇的纯菌种。具体做法为选择个体典型，朵多，盖厚无病虫危害，最好是用未成熟的菌蕾作为分离材料。用75%酒精冲洗种菇表面进行消毒，再用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸干。用消过毒的刀片在菇柄中部纵切一刀，用手掰开菌盖，在菌盖与菌柄交界处取米粒大小的小块组织，移接到PDA斜面培养基上，加上棉塞，在25 °C条件下培养。
[0019]菌种的纯化及扩大培养:菌种分离培养3d~4d后,选取菌丝萌发早,长势旺的菌落，转管扩大培养。经扩大培养菌种一般在8d~12d可长满管。香燕菌种肉眼观察PDA斜面上菌丝生长洁白，羽毛状沿着培养基表面延伸，至此得到试管菌种(即母种)。
[0020]4)耐酸性香菇诱变菌丝筛选
[0021](I)紫外辐照处理
[0022]在培养了 6d的香菇菌丝中，挑选萌发快，扩散快，洁白粗壮的菌丝，用打孔器在菌丝的尖端组织处，取出数个菌丝块，然后用接种铲转接于另一块经灭菌的PDA平板培养基中心，于25°C恒温培养2d后，进行香菇菌丝的紫外诱变。
[0023]诱变前，开启紫外灯20~30min，使波长稳定，恒温箱25°C培养。将菌株分为9组(3次重复)，设紫外线照射0.5、l、5、10、15、20、25、30min和出发菌株(CK)。长在固体培养基上的菌丝在25°C的培养箱中培养48h后取出，选择长势一致的菌丝立即进行辐照处理。选用紫外线灯20W，辐射强度90 μ W / cm2，照射距离30cm，常规方法照射。处理后用黑布包裹，置于恒温箱25°C下继续培养。用十字交叉法测菌丝日均长速，并观察记录菌丝长势。
[0024](2)诱变菌丝拮抗性试验
[0025]将经过辐照处理的菌丝在25°C恒温箱中继续培养3~4d左右，观察菌丝恢复生长情况，选择菌丝长速、色泽变化或菌丝形态变化的菌株进行拮抗试验，挑取经过不同辐照处理的菌丝接种于空白培养基的一端，另一端接种对照菌丝，置于25°C恒温箱中培养6d，观察拮抗线产生情况。
[0026]用紫外线照射处理后有明显变化的菌丝和对照菌株的菌丝各一块，同时接入同一培养皿PDA培养基两端，相距Icm左右，如中央产生了明显拮抗线的，说明了菌株已产生了变异，不产生拮抗线的则表明菌株没有发生变异。[0027](3)耐酸性诱变菌株筛选
[0028]耐酸香菇菌株的初筛:分别将筛选后的变异菌株及出发菌株同时接种到液体种子培养基中，每个处理设置3次重复，(观察菌丝在？!1=4.0、3.0、2.0、1.5、1.0下)于25°C，150r / min恒温培养8d后的生长情况，进行香菇耐酸性菌株的初选。
[0029]耐酸香菇菌株的复筛:将初步筛选出的耐酸性菌株分别接种到选择性培养基上，在pH=4.0,3.0,2.0、1.5、1.0下于25°C恒温继续培养，进行香菇耐酸性菌株的复筛。
[0030]选择性培养基组成与液体种子培养基组成相同，初筛的耐酸性香菇菌丝种子液及出发菌株种子液，分别每次取100 μ L，接种到含有IOg无菌珍珠岩的选择性平板培养基上，在平板的五个不同位置接种，每个菌株设5个重复，定期观察。
[0031]经过诱变、珍珠岩固体培养基筛选、拮抗反应和测定液体培养下菌丝生物量、胞外多糖含量等，初步确定了三个耐酸突变体Atm-O1、02和03。
[0032]在低pH培养基中对三个突变体分别培养12天，三个重复；测定的菌丝生物量、胞外多糖含量，结果表1。由表1可知，Atm-02表现最佳，所以，以此为材料进行以下实验。
[0033]对培养的Atm-02定期取样，测定的菌丝生物量、胞外多糖含量，结果表2。由表可知，菌丝在培养12天是菌丝生物量和胞外多糖均达到峰值，可以终止发酵。
[0034]表1起始pH对三个耐酸突变体的菌丝生物量和胞外多糖的影响
[0035]
【权利要求】
1.采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过PH1.0-4.0液体培养基振荡培养、pHl.0-4.0培养液浸湿珍珠岩固体培养基培养,初步筛选出耐酸菌丝体。
2.初选耐酸菌丝体经过1-5次的pHl.0-4.0培养基的继代培养和典型的拮抗测试，复筛出耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系。
3.优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养耐酸突变体。
4.从发酵液中收集滤液，经热水浸提一香菇粗多糖一Sevag法脱蛋白一H2O2脱色一透析脱盐一DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析一S^hadex G-100柱层析一纯多糖(中性多糖、酸性多糖)； 纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。
【文档编号】C12P19/04GK103535352SQ201310444657
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】李兴林, 韩广建, 曹爱佳, 张国运, 曹雪飞, 赵娜, 韩杨, 贾士儒 申请人:天津科技大学