盒形藻的检测探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种盒形藻的检测探针，属于核酸检测领域。具体针对盒形藻的rRNA特定区域合成以S1酶保护分析探针为核心的一组探针，联合S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对盒形藻rRNA的定性定量检测。检测探针包括三条相互关联的寡核苷酸探针：S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针。本发明探针适用性好，大大方便了特异探针的寻找和实现。本发明的稳定性远远高于夹心杂交技术。
【专利说明】盒形藻的检测探针
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组藻类检测的寡核苷酸探针，具体地说是针对盒形藻定性与定量检测的特异性探针。属于核酸检测领域。
【背景技术】
[0002]盒形藻(Odontella sinensis)是ー种在世界范围内广泛存在的广温广盐性浮游植物，也是我国近海最常见的硅藻优势种之一。本种是海洋次级生产者的良好饵料，同时又是我国近海常见的赤潮生物和良好的污染指示物，在经济海藻养殖区，常与海带、紫菜等争夺营养，改种的大量水华可引起经济藻类变色，甚至腐烂而失去食用和商业价值。因此，及时、准确、快速地检测盒形藻，了解其在养殖区的种群动态，当其数量增加时及时控制，对海洋养殖业具有重要意义。传统的利用光学显微镜直接观察和计数的鉴别方法，过程烦琐、费时、费力，并需要有经验的分类专家參与其中。当样品量多，生物多样性丰富，监测范围广时工作量极大，因此主要用于藻的定性和分离，而不适用于藻的定量与大范围监测研究。所以，发展用于快速、准确检测盒形藻的新方法和新技术极具现实意义。但是，目前国际国内关于这方面的研究进展不大，尚未形成非常有效的对该藻进行定性和定量检测的成熟技术。由于rRNA被认为是与藻类的系统进化密切相关的序列，而且真核生物细胞中rRNA含量非常高，可以达到IO6~IO7个拷贝，rRNA是夹心杂交的很好的靶点。
[0003]经对现有技术文献的检索发现，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全细胞和“三明治”杂交中识别南方菱形藻》(美国《藻类学杂志》，1996，35 (3),190~197)一文中将提取的RNA或者藻细胞裂解液在一定条件下与结合在96孔板上的寡核苷酸探针杂交后，再用一标记的信号探针与之杂交，最后进行酶标抗体显色反应，取得了较满意的结果。该技术现在海洋藻类的监测中已经有所应用。但到目前为止，应用该技术能够检测的微藻只限于有限的几种(其中包括了盒形藻)。其主要缺点是:一，因捕获探针的长度仅10~30bp,因此能够有效区别亲缘关系较近的微藻的捕获探针数量极少；二，在整个检测过程中都需要防止RNA降解，然而洗涤、抗体反应等各步骤极易造成RNA降解，因此操作难度大、检测结果波动性大。`
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组针对盒形藻rRNA的特异性的盒形藻的检测探针，依据这组探针对该藻进行SI酶保护分析和夹心杂交检测，实现对该藻的快速定性和定量。
[0005]本发明用于对该藻进行SI酶保护分析和夹心杂交检测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针:S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针，所述的SI酶保护分析探针，是指与盒形藻rRNA互补而且用于SI酶保护分析方法的寡核苷酸探针，所述的抓捕探针，是指与SI酶保护分析探针的一端结合，这一端通常为3’端，另外一端标记有生物素，从而将经过SI酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的SI酶保护分析探针捕获下来的探针，所述的信号探针或者连接探针能够在抓捕探针捕获Si酶保护分析探针后，结合于Si酶保护分析探针的另一端的的探针为连接探针，同时该探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针互补。
[0006]SI酶保护分析探针在进行生物信息学比对分析时，仅与盒形藻核糖体小亚基30~100区域核苷酸互补,而与其它藻核糖体RNA无同源性,长度为60bp,在一定的条件下可特异性结合于盒形藻的 rRNA 上，序列为:5’ -TCGTTACTAATGACTCCGTCAGCACCGTAAGGGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGG。通过测定盒形藻的rRNA序列，进行多序列比较，寻找盒形藻的特征序列，作为该藻的rRNA特异区域，然后根据该rRNA特异区域序列(特征序列)设计SI酶保护分析探针。寻找生物特异性区域的方法以及根据特异区域设计探针都采用现有技术。已有的实验表明，不同藻rRNA之间若存在2~3个以上核苷酸的连续错配或者缺失就可以作为特异探针设计的靶序列。
[0007]抓捕探针特异性结合于SI酶保护分析探针一端，长度为27bp，序列特征为:5’ -AGCAATGATTACTGAGGCAGTGGCCCT，在5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨基基团以及其他任何可以用来标记可以用于固定于固体基质的标记。
[0008]信号探针或者连接探针在一端与SI酶保护分析探针互补，而在另一端具有通用信号探针互补区，与通用信号探针互补结合，长度为26bp，序列为:5’ -TTAGTTTCAGAAACCCAAGGCCCCCC ;该序列上标记各种检测的信号，具体包括:荧光素、地高辛、生物素用于信号检测的序列，或者与通用的信号探针互补的一段序列。
[0009]通用信号探针与连接探针的一端(不同于与SI酶保护分析探针互补结合的一端)互补。常用的标记物包括(但并不限于):地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等。
[0010]简而言之，本发明是针对盒形藻的rRNA特定区域合成以SI酶保护分析探针为核心的一组探针，联合SI酶保护分析和夹心杂交技术实现对盒形藻rRNA的定性定量检测。
[0011]本发明的这组探针可用于以SI酶保护分析和夹心杂交技术检测样品中是否存在盒形藻及其数量，所述的检测过程包括下列步骤:
[0012](a)待检测样品和SI酶保护分析探针的混合
[0013]在该步骤中，可以将经裂解处理已释放出rRNA的待检测的微藻样品与SI酶保护分析探针混合。也可以将待检测的微藻样品与SI酶保护分析探针直接混合，然后再进行裂解处理，从而释放rRNA。一旦释放出的rRNA包含对应于SI酶保护分析探针的靶序列，经过杂交，则会与SI酶保护分析探针形成双链。
[0014](b) SI 酶处理
[0015]当SI酶保护分析探针与待检测生物的rRNA杂交后，用适当浓度(通常为0.5U~2U/ii I,较佳地为IU/ii I)的SI酶消化过量游离的探针；当该探针与其他非目标rRNA反应时，由于杂交体存在切口或小缺口，SI酶亦能将该探针切断；最终保留下与完全匹配的SI酶保护分析探针和盒形藻的rRNA形成的DNA/RNA双链，而且该双链的量代表了样本中相应的rRNA的量。
[0016](c) DNA-RNA杂合体的变性
[0017]将DNA/RNA双链杂合体变性为DNA单链(即SI酶保护分析探针)和RNA单链。合适的变性方法没有特别限制，可以用本领域常用的各种变性方法，例如热变性等。例如，加入中和溶液后加热，使SI酶保护分析探针和目标生物的rRNA形成的杂合体变性，从而释放出保留下来的SI酶保护分析探针。由于RNA不稳定，解链形成的RNA单链易被内源或外源的RNA酶降解。
[0018](d)捕获SI酶保护分析探针
[0019]将保留有SI酶保护分析探针的溶液与预先固定于固相载体上的抓捕探针杂交，将Si酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上，并洗涤除去非特异的结合。
[0020]( e )结合带可检测信号的探针
[0021]用连接探针与被捕获的SI酶保护分析探针杂交，并洗涤除去非特异的结合，再用信号探针与连接探针结合，并洗涤除去非特异的结合。
[0022](f)信号检测
[0023]可用本领域常规方法对可检测信号进行信号检测。例如信号探针上可以标记上荧光信号，这样通过激发荧光来读取数据；也可以在信号探针上标记上地高辛、荧光素或者生物素等，然后通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体或者亲和素与之反应；最后加入发光底物或者显色底 物(TMB或者NPP等)，通过探测发光强弱或者吸光度来判读信号。
[0024]本发明的主要优点在干:
[0025](I)探针适用性好:夹心杂交特异识别的关键是抓捕探针的特异性，一般情况抓捕探针约长20~30核苷酸，该探针要具有特异性，必须与其他非目标生物的rRNA分子要有较大的差异，尽管不同生物的rRNA在进化上会有差异，但在找到并成功验证亲缘关系较近的生物之间的特异性探针并不是一件容易的事，这可能也是夹心杂交技术发展到现在只有找到很少量抓捕探针的原因之一。本发明中涉及的SI酶保护分析探针，尽管长度在60个核苷酸左右，但并不要求探针全长都要有特异性，而只要求探针的中间区域有几个核苷酸的差异即可，这大大方便了特异探针的寻找和实现。
[0026](2)稳定性高:夹心杂交技术成功执行的关键之一在于保证RNA分子在整个过程不被降解，特别要保证抓捕探针与信号探针之间的那段目标RNA分子(可能在几十到几百个核苷酸之间)在整个实验过程的完好无损。但由于实验过程涉及抗原抗体反应和多次洗涤步骤，这为RNA酶对RNA分子降解提供了较多机会，因此要保证目标RNA分子不被降解有非常大的难度。即使最終能够实现定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本发明中直接与rRNA分子相关的过程只有SI酶保护分析探针与rRNA分子杂交这一歩，只要杂交裂解液加入适当的RNA酶抑制剂就能保证杂交时rRNA分子不被降解或很少被降解，实验操作的其他步骤都是针对稳定的DNA分子进行的，相对比较容易执行。因此本发明的稳定性远远高于夹心杂交技木。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是盒形藻的检测探针用来探测各种不同藻的示意图。
[0028]图2是对不同细胞数的盒形藻的检测曲线示意图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图，在具体实施例进ー步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册'(New YorkiColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。[0030]实施例:应用针对rRNA的SI酶保护分析和夹心杂交技术对盒形藻定性定量检测。
[0031]在本实施例中，将SI酶保护分析技术和夹心杂交技术联合用来实现对海洋赤潮生物盒形藻(Odontella sinensis.)的定性和定量检测,步骤如下:
[0032]1.1盒形藻rRNA特异区域的寻找和SI酶保护分析探针的设计与合成
[0033]通过测定盒形藻核糖体小亚基18S rRNA序列并与其它藻类的rRNA序列进行多序列比较，找到其在小亚基rRNA的30~100区域与其它藻类不同，确定该区域序列为特征序列；根据特征序列设计和合成SI酶保护分析探针0D0_S1:5’ -TCGTTACTAATGACTCCGTCAGCACCGTAAGGGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGG (SEQ ID N0.1)。
[0034]根据SI酶保护分析探针设计和合成夹心杂交所需的其他探针:
[0035]抓捕探针0D0_CAPT:
[0036]5’-Biotin-AGCAATGATTACTGAGGCAGTGGCCCT (SEQ ID N0.2)，与 SI 酶保护分析探针的3’端互补,在5’端有生物素(Biotin)标记；
[0037]连接探针SYM_LINK:
[0038]5’-TTAGTTTCAGAAACCCAAGGCCCCCCTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG (SEQ IDN0.3)，在5’端的26个核苷酸与SI酶保护分析探针的5’端互补，在3’端的32个核苷酸与通用信号探针的5’端互补。
[0039]1.2抓捕探针固定于酶标板
[0040]抓捕探针的固定方法:在预先包被有亲和素的酶标板(Pierce公司)的每一孔中加入100 ill溶解于碳酸盐缓冲液CBS (pH7.2)的40nM抓捕探针，37°C静置2小时。用磷酸盐缓冲液PBS洗三次备用。
[0041]1.3S1酶保护分析
[0042]将用f2培养基培养的海藻样品计数后，离心收集于1.5ml塑料管中，弃去上清，加入浓度为50nM SI酶保护分析探针的1000 U I裂解液(0.8%十二烷基磺酸钠SDS’ 1.2M尿素，20%甲酰胺，0.3M氯化钠，50mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.0)。
[0043]进行盒形藻的特异性验证时，将盒形藻约5E+04个细胞，裸甲藻、塔玛亚历山大藻、角毛藻、赤潮异弯藻、锥状斯氏藻、棕囊藻、红色裸甲藻、海洋原甲藻、微型原甲藻、尖刺菱形藻等各约1E+06个细胞分别进行上述处理。
[0044]进行盒形藻的检测曲线分析时，将过滤收集到的盒形藻样品用含有SI酶保护分析探针的裂解液逐级稀释5次共获得6个样品。
[0045]对于海藻样品和SI酶保护分析探针的混合物，超声波处理两分钟，将混合溶液在95°C放置10分钟，然后70°C杂交2小时。自然冷却后加入500 ill含有800U SI酶(Promega公司)的SI酶解缓冲液(50mM硫酸锌，500mM醋酸钠，50mM氯化钠pH4.5)，在50°C酶切处理30分钟。
[0046]1.4DNA-RNA杂合体的变性
[0047]加入250 ill变性缓冲液(1.5M氢氧化钠，300mM EDTA)，95°C处理10分钟，自然冷却后用于夹心杂交。此时DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA(即曾结合于靶序列的SI酶保护分析探针)和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含曾结合于靶序列的SI酶保护分析探针。
[0048]1.5夹心杂交[0049]抓捕:将IOOUl上述变性后的反应混合液分别移入到预固定有抓捕探针的酶标板微孔中，50°C杂交I小时，用含有0.1%SDS的0.1XSSC洗涤液洗6次。
[0050]夹心杂交:每孔加入含有100iil5nM连接探针的杂交缓冲液(2XSSC，0.1%SDS),于50°C杂交30分钟，用含有0.1%SDS的0.1XSSC洗涤液洗6次；每孔加入含有100ul5nM信号探针的杂交缓冲液(2XSSC，0.5%SDS)于50°C杂交30分钟，用含有0.1%SDS的0.1XSSC洗涤液洗6次。
[0051]1.6信号检测 [0052]酶标板用磷酸缓冲液(PBS)洗6次；每孔加入含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体(购自Roche公司)，37 °C孵育30分钟，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB (购自Pierce公司)显色液100iU，37°C处理15分钟后，每孔加入50 yl2M硫酸终止反应。将酶标板置于酶标仪上于450nm测定光吸收值。
[0053]1.7 结果
[0054]检测结果如图1和图2所示。
[0055]图1显示了用针对盒形藻的探针探测各种不同的藻的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。
[0056]对数据用常规统计方法进行拟合，获得如下关系
[0057]y=2.21E-05x-0.0048
[0058]R2=0.9987 ；
[0059]X为样品中盒形藻的细胞数，y为实际測定的0D.450, R2为相关系数。
[0060]下表列出了用本实施例方法測定的盒形藻样品数量与显微计数结果的比较:
[0061]
【权利要求】
1.一种盒形藻的检测探针，其特征在于，用于对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检 测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针；所 述的S1酶保护分析探针，是指与盒形藻rRNA互补而且用于S1酶保护分析方法的寡核苷酸 探针，序列为：5’ -TCGTTACTAATGACTCCGTCAGCACCGTAAGGGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGG ;所述的抓 捕探针，是指与S1酶保护分析探针的一端结合，另外一端标记有固定基团，从而将经过S1 酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的S1酶保护分析探针捕获下来的探针，序列特征 为：5’ -AGCAATGATTACTGAGGCAGTGGCCCT ;所述的信号探针能与S1酶保护分析探针结合，同 时该信号探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针 互补，序列为：5’ -TTAGITTCAGAAACCCAAGGCCCCCC。
2.根据权利要求1所述的盒形藻的检测探针，其特征是，所述的盒形藻rRNA之间若存 在2?3个以上核苷酸的连续错配或者缺失可作为特异探针设计的靶序列。
3.根据权利要求1所述的盒形藻的检测探针，其特征是，所述的S1酶保护分析探针， 在进行生物信息学比对分析时，仅与盒形藻核糖体小亚基30?100区域核苷酸互补，而与 其它藻核糖体RNA无同源性，长度为60bp，在一定的条件下可特异性结合于盒形藻的rRNA 上。
4.根据权利要求1所述的盒形藻的检测探针，其特征是，所述的抓捕探针特异性结合 于S1酶保护分析探针一端，长度为27bp，在抓捕探针5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨 基基团以及其他任何可用来标记的用于固定于固体基质的标记。
5.根据权利要求1所述的盒形藻的检测探针，其特征是，所述的信号探针特异性结合 于S1酶保护分析探针一端，该信号探针上标记有荧光素、地高辛、生物素以及其他任何可 用来给出信号的基团，或者与通用的信号探针互补的一段序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103555834SQ201310499622
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】米铁柱, 王国善, 谭俊哲 申请人:中国海洋大学