刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，该刺五加多糖优选经脱脂、水提、醇沉、离子交换和透析工艺获得，制备方法简单稳定高效，适合工业化生产。本发明中的刺五加多糖经哺乳动物细胞和秀丽线虫疾病模型试验证实，不仅能够有效抑制神经毒性化合物的细胞毒性，缓解秀丽线虫疾病模型中多聚谷氨酰胺异常聚集引起的神经毒性，还能显著降低秀丽线虫疾病模型体内活性氧自由基水平并延长秀丽线虫在氧化胁迫下的存活率，表明其具有良好的神经保护作用。
【专利说明】刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于健康食品/保健食品【技术领域】，具体涉及刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用。
技术背景
[0002]衰老是一种不可避免的自然现象，容易引发心血管疾病、癌症、神经系统疾病等多种疾病。其中，神经系统疾病发病原因是神经元进行性变性死亡导致神经系统受损，主要影响患者的认知和运动功能，致残致死率极高。随着全球人口老龄化程度的加剧，神经系统疾病已经成为严重危害人们生命健康和生活质量的重大脑疾病，给患者家庭和社会带来极大的心理和经济负担。尽管对此类疾病治疗药物的开发投入日益增加，但目前尚无有效治疗药物，而且对其前期发生发展过程缺乏关注和预防，因此积极开发具有神经保护功效的健康食品/保健食品对防治神经系统疾病将具有重大社会意义。
[0003]大量研究表明，多种神经系统疾病的发生发展都涉及到蛋白质的异常聚集及聚集毒性等胁迫因素，例如，亨廷顿舞蹈病的主要病理特征表现为细胞内由多聚谷氨酰胺(polyglutamine;polyQ)异常延伸引起的亨廷顿蛋白包涵体。这些蛋白质异常聚集形成的产物将诱发氧化、炎症等多种胁迫反应，导致神经元损伤并产生神经功能衰退。因此，通过抑制疾病蛋白质异常聚集以及缓解由异聚蛋白引起的氧化等毒性胁迫损伤将是防治神经系统病症的重要策略。
[0004]我国传统中医在衰老和衰老相关疾病方面积累了丰富的研究和临床经验，多种中草药长期用于延缓衰老和神经保护等用途。例如，刺五加自古即被视为具有添精补髓及抗衰老作用的良药。明朝李时珍《本草纲目》称刺五加“以五叶交加者良，故名五加，又名五花。五加治风湿，壮筋骨，其功良深，宁得一把五加，不用金玉满车”，又以“文章作酒，能成其味，以金买草，不言其贵”之说，对刺五加做了很高的赞誉。现代研究表明，刺五加多糖是刺五加的主要药效成分之一，具有抗氧化、抗辐射、免疫调节和抗肿瘤等多种生物学活性，在保健领域具有巨大的开发和应用潜力。然而这些研究大多集中在抗肿瘤和抗氧化方面，对刺五加多糖在神经保护和神经系统疾病领域中的研究和应用关注不足。因此，加强刺五加多糖在神经保护功效方面的研究不仅有利于拓宽其本身的应用范围，还能为神经系统疾病的防治提供新的活性物质，并能推动多糖在医药保健领域的深入应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品(保健食品也称为健康食品或功能食品)中的应用。
[0006]其中所述的神经保护功效是指对以蛋白质异常聚集、氧化胁迫和特定神经细胞衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病的防治作用。
[0007]本发明中所述的刺五加多糖优选通过以下方法制备获得:以刺五加为原料，经含脱脂、水提、醇沉、离子交换和透析等工序制备获得刺五加多糖，制备获得的刺五加多糖具有神经保护作用，能够制备具有神经保护功效的保健食品。
[0008]本发明在刺五加多糖的制备过程中，各工序的具体参数如下:
[0009]脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，刺五加和乙醇的质量体积比为l:2g/mL?l:20g/mL,脱脂温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，刺五加和水的质量体积比为1: 2g/mL?l:20g/mL，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?10h，水提取后，获得提取液；醇沉时，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的体积比为3:1?5:1。
[0010]离子交换为阴离子交换，将醇沉物溶解后过阴离子交换柱，依次采用水和洗脱液进行洗脱，洗脱液过透析袋透析，透析液经浓缩和干燥处理，获得刺五加多糖。
[0011]所述阴离子交换的材料优选为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂；透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD。
[0012]阴离子交换时，洗脱液优选为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸。
[0013]本发明中所述的刺五加优选是指刺五加的药用部位根或根皮。
[0014]本发明提供的刺五加多糖具有神经保护功效是指其能够在细胞和整体动物水平上显著抑制神经毒性化合物的细胞毒性，抑制秀丽线虫疾病模型中多聚谷氨酰胺异常聚集引起的神经毒性，还能显著降低秀丽线虫疾病模型体内活性氧自由基水平并延长其在氧化胁迫下的存活率，从而可用于防治包括阿尔茨海默症和亨廷顿舞蹈病等在内的以蛋白质异常聚集、氧化胁迫和特定神经细胞和组织逐渐衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病。
[0015]本发明提供的刺五加多糖用途还包括在制备具有神经保护功效的健康食品或保健食品中的应用。将上述刺五加多糖添加其它原料如乳清蛋白、辅料如麦芽糊精，可制备成为具有神经保护功效的健康食品或保健食品。
[0016]本发明具有如下优点:
[0017](I)本发明制备的刺五加多糖制备工艺简单完善，稳定高效，适合工业化生产；
[0018](2)本发明制备的刺五加多糖经证明其在哺乳动物神经细胞和秀丽线虫整体动物水平上对神经系统疾病相关的蛋白质异常聚集及其神经毒性、氧化胁迫损伤均有抑制作用，表明其可应用于具有神经保护功效的固液制剂健康食品或保健食品中，为神经系统疾病的防治和健康老龄化提供了新型方案，并能促进多糖产品的深入应用和中药现代化发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面通过【具体实施方式】及药效学研究结果对本发明作进一步说明。
[0020]图1为实施例4中刺五加多糖分别抑制AP 42、3_硝基丙酸、L-谷氨酸和百草枯细胞毒性的数据表征图，其中图1A表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖缓解A0 42对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的细胞毒性，图1B表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖缓解3-硝基丙酸对SH-SY5Y的细胞毒性，图1C表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖缓解L-谷氨酸对SH-SY5Y的细胞毒性，图1D表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖缓解百草枯对SH-SY5Y的细胞毒性，其中*表示p〈0.05 ；
[0021]图2为实施例5中刺五加多糖抑制多聚谷氨酰胺在秀丽线虫体内异常聚集毒性的数据表征和显微示意图，其中图2A表征未经处理和经2mg/mL刺五加多糖处理的HA759秀丽线虫ASH神经元的存活状态，图2B表征2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集对HA759秀丽线虫ASH神经元的神经毒性，图2C表征2mg/mL刺五加多糖改善多聚谷氨酰胺聚集毒性损伤的ASH神经元行为学功能，其中*表示p〈0.05 ；
[0022]图3为实施例6中刺五加多糖降低秀丽线虫多聚谷氨酰胺模型体内活性氧水平和提高该模型氧化胁迫存活率的数据表征图，其中图3A表征2mg/ml刺五加多糖降低HA759秀丽线虫体内活性氧自由基水平，图3B表征2mg/ml刺五加多糖提高HA759秀丽线虫在百草枯氧化胁迫下的存活率。
【具体实施方式】
[0023]下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0024]实施例1
[0025]本实施例提供的一种刺五加多糖，其通过如下方法制备获得:将刺五加根及根皮粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，60°C下加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:15 (g/mL)加水，在90°C下加热搅拌提取8h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照1:4体积比将4倍体积乙醇加入提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过DEAE-sepharose葡聚糖凝胶阴离子交换柱，依次采用水和1.0mol/L氯化钠溶液洗脱，收集1.0mol/L氯化钠溶液的洗脱液，采用1.0kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得刺五加多糖。
[0026]实施例2
[0027]本实施例提供的一种刺五加多糖，其通过如下方法制备获得:将刺五加根及根皮粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加热搅拌回流5h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比l:5(g/mL)加水，在80°C下加热搅拌提取3h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照1:4体积比将4倍体积乙醇加入提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过DEAE-sephadex A_25纤维素阴离子交换柱，依次采用水和1.0mol/L氯化铵溶液洗脱，收集1.0mol/L氯化铵溶液的洗脱液，采用3.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得刺五加多糖。
[0028]实施例3
[0029]本实施例提供的一种刺五加多糖，其通过如下方法制备获得:将刺五加根茎粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，80°C下加热搅拌回流7h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在70°C下加热搅拌提取6h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照1:5体积比将5倍体积乙醇加入提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过D900型阴离子交换树脂，依次采用水和0.5mol/L醋酸钾溶液洗脱，收集0.5mol/L醋酸钾溶液的洗脱液，采用2.0kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得刺五加多糖。
[0030]实施例4
[0031]42 ( 3 -淀粉样蛋白 42 片段，0-amyloid peptide42,A0 42)蛋白聚集、3-硝基丙酸、L-谷氨酸和百草枯分别是线粒体呼吸毒性、兴奋性氨基酸毒性和氧化胁迫毒性的诱导剂，均能够产生与多种神经系统疾病相关的神经毒性。抑制这些神经毒性化合物的细胞毒性无疑能够有效改善神经衰退症状。将实施例1制得的刺五加多糖，按照l_4mg/mL浓度分别加入到以50 ii M AP42、7.5mM3-硝基丙酸、IOmM L-谷氨酸和0.8mM百草枯造模的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中。对照组采用造模处理，但用细胞培养基代替多糖溶液，空白组未用造模试剂和多糖处理。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液继续孵育4h。孵育结束后吸弃上清，加入DMSO并振摇，在570nm处测定吸光值，细胞存活率为多糖组吸光值与对照组吸光值的比值。细胞活力值以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0032]图1A显示，A P 42在50 ii M时能够显著降低SH-SY5Y细胞活力，刺五加多糖在4mg/ml浓度下能够改善AP 42处理后的细胞存活率，相比于对照提高了 13.6%。
[0033]图1B显示，3-硝基丙酸在7.5mM时能够显著降低SH-SY5Y细胞活力，而刺五加多糖在l-4mg/ml浓度范围内均能够缓解3-硝基丙酸的神经毒性，当多糖浓度为2mg/ml时，其细胞存活率相比于对照组提高了 7.7%。
[0034]图1C显示，L-谷氨酸在IOmM时能够显著降低SH-SY5Y细胞活力，而刺五加多糖在l-4mg/ml浓度范围内表现出抑制L-谷氨酸神经毒性的活性，当多糖浓度为4mg/ml时，其细胞存活率相比于对照组提高了 22.2%。
[0035]图1D显示，百草枯在0.8mM时能够因氧化损伤显著降低SH-SY5Y细胞活力，而刺五加多糖在l_4mg/ml浓度范围内能够抑制百草枯的神经毒性，当多糖浓度为2mg/ml时，其细胞存活率相比于对照组提高了 14.4%。
[0036]这些结果表明，刺五加多糖能够在人神经细胞水平上抑制多种神经毒性化合物的神经毒性，表明其具有良好的体外神经保护作用。
[0037]实施例5
[0038]秀丽线虫转基因模型HA759是利用渗透压相关基因osm-10促使polyQ (多聚谷氨酰胺，polyglutamine, polyQ)和GFP在其头部ASH神经元中表达，polyQ聚集将产生显著毒性，导致ASH神经元快速进行性衰亡(表现为荧光消失)。因此可以通过观察ASH神经元的存活率来检测药物对PolyQ聚集介导的神经毒性的缓解作用。将实施例2制得的刺五加多糖，以l_4mg/mL浓度分别加入LI期的秀丽线虫多聚谷氨酰胺模型HA759幼虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于15°C下培养3天。收集HA759秀丽线虫，加入叠氮化钠溶液使其麻痹，混匀后滴加在琼脂糖垫上，在荧光显微镜下观察每条秀丽线虫ASH神经元的GFP荧光点。随机统计?100条秀丽线虫，统计出ASH神经元的存活率。ASH神经元存活百分率=ASH神经元存活的秀丽线虫数目/ (ASH神经元存活的秀丽线虫数目+ASH神经元死亡的秀丽线虫数目)X 100%。存活率以mean土SEM表示，使用one-way ANOVA分析和Tukeypost-hoc test比较多糖组和对照组的差异性。
[0039]结果如图2A所示，未经多糖处理的HA759秀丽线虫的ASH神经元因polyQ聚集而衰亡(荧光消失)，加入刺五加多糖后ASH神经元依然存活(荧光存在)。图2B显示，对照组HA759秀丽线虫ASH神经元在3天后的存活率为38.9%，而采用刺五加多糖处理后，ASH神经元的存活率明显提高，当多糖浓度为2mg/ml和4mg/ml时，ASH神经元的存活率相比于对照组分别提高至58.1%和59.7%。该结果表明刺五加多糖能够缓解polyQ异常聚集介导的神经毒性。
[0040]秀丽线虫的ASH神经元控制其高渗回避行为能力，因此在受到引诱和高渗溶液阻拦时，ASH神经元未衰亡的HA759秀丽线虫具有趋向引诱剂后回避高渗溶液的双重行为特征；而ASH神经元死亡的HA759秀丽线虫仅具有趋向弓I诱剂的趋化行为，丧失对高渗溶液的回避能力。将实施例2制得的刺五加多糖，以l_4mg/mL浓度分别加入LI期的HA759幼虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于15°C下培养3天。收集HA759线虫，用PBS洗去培养液中的食物残渣。以8M甘油(高渗厌恶回避试剂)、双乙酰(引诱趋化试剂)、叠氮化钠(麻醉剂)制备HA759秀丽线虫的趋化回避平板，将处理后的秀丽线虫置于平板上，在20°C中培养1.5h后取出统计秀丽线虫的分布情况，从而计算秀丽线虫对高渗溶液的回避率。回避率(avoidance index)计算公式如下:回避率=(回避区内秀丽线虫数目/秀丽线虫总数)X 100%,回避率以 mean土SD 表不，使用 one-way ANOVA 分析和 Tukey post-hoc test 比较多糖组和对照组的差异性。
[0041]结果如图2C所示，未经多糖处理的对照组有54.5%的秀丽线虫在甘油线附近折返回避，采用刺五加多糖处理后，当多糖浓度为2mg/ml时，HA759秀丽线虫的回避率提高至69.8%，表明刺五加多糖对ASH神经元具有保护作用，与如图2A和图2B所示结论一致。
[0042]以上结果显示，刺五加多糖能够在神经元细胞和动物行为学水平上抑制polyQ异常聚集导致的神经毒性，表明其具有良好的体内神经保护作用。
[0043]实施例6
[0044]将实施例3制得的刺五加多糖，以2mg/mL浓度加入LI期的HA759秀丽线虫幼虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于15°C下培养3天。收集HA759秀丽线虫，加入含1%吐温20的PBS，然后转移至玻璃匀浆器中在冰上匀浆，收集匀浆再加入DCFH-DA探针溶液(活性氧自由基含量的指示剂)，在37°C下避光孵育，然后用荧光酶标仪检测荧光值，激发波长为485nm，发射波长为530nm。相对荧光强度以mean土 SEM表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0045]结果如图3A所示，对照组的DCF相对荧光值为47.8，采用2mg/ml刺五加多糖处理后，DCF相对荧光值下降至29.1，表明刺五加多糖能够显著降低HA759秀丽线虫体内活性氧自由基水平，具有良好的体内抗氧化活性。
[0046]将实施例3制得的刺五加多糖，以2mg/mL浓度加入经5-FUDR处理的L4期HA759秀丽线虫幼虫中，同时以IOOmM百草枯进行氧化胁迫造模，对照组同样处理，但以等体积的S Medium代替多糖溶液。置于20°C中培养，以加入多糖和百草枯的时间计为第0h，每隔12h统计秀丽线虫的存活状况，直至其全部死亡,统计过程中将身体僵直不动并对轻微震动无反应的秀丽线虫判断为死亡状态。以每个处理组的秀丽线虫样本量80-100条为准，秀丽线虫存活率用Kaplan-Meier法进行分析,并以log-rank test比较多糖组与对照组的差异性。
[0047]结果如图3B所示，加入百草枯后将产生急性氧化胁迫而导致秀丽线虫死亡，对照组的平均存活时间为62h，而采用2mg/ml刺五加多糖处理后，秀丽线虫的平均存活时间显著延长至71.4h，表明刺五加多糖能够有效对抗百草枯的氧化胁迫，从而改善与神经系统病症相关的氧化损伤。
[0048]经上述哺乳动物神经细胞和秀丽线虫疾病模型试验结果证实，刺五加多糖不仅能够有效抑制多种神经毒性化合物的神经毒性(见实施例4)，缓解polyQ异常聚集诱导的神经毒性(见实施例5)，还能显著降低疾病模型体内活性氧自由基水平并提高疾病模型在氧化胁迫环境下的存活率(见实施例6)。这些结果充分证明刺五加多糖具有良好的神经保护作用，可用于防治神经系统疾病。
[0049]实施例1
[0050]将实施例1制得的刺五加多糖，根据需要添加适量乳清蛋白、麦芽糊精制备成为具有神经保护功效的粉末状态健康食品或保健食品，还可以添加其它常规辅料制成常规剂型。
[0051]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:所述的神经保护功效是指对以蛋白质异常聚集、氧化胁迫和特定神经细胞衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病的防治作用。
3.根据权利要求1所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是所述的刺五加多糖通过以下方法制备获得:以刺五加为原料，经含脱脂、水提、醇沉、离子交换和透析工序制备获得，所述刺五加多糖具有良好的神经保护作用。
4.根据权利要求3所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，刺五加和乙醇的质量体积比为1:2?20g/mL，脱脂温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，刺五加和水的质量体积比为1:2?20g/mL，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?IOh ;醇沉时，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的体积比为3?5:1。
5.根据权利要求3所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:所述离子交换为阴离子交换，将醇沉物溶解后过阴离子交换柱，依次采用水和洗脱液进行洗脱，洗脱液过透析袋透析，透析液经浓缩和干燥处理，获得刺五加多糖。
6.根据权利要求5所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:所述阴离子交换的材料为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂。
7.根据权利要求5所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:洗脱液为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸。
8.根据权利要求5所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD。
9.根据权利要求3所述的刺五加多糖在制备具有神经保护功效的保健食品中的应用，其特征是:所述刺五加是指刺五加的药用部位根或根皮。
【文档编号】A23L1/09GK103609937SQ201310574757
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】胡明华, 李海峰, 梁明, 马方励, 马忠华, 肖凌云, 张菊 申请人:无限极（中国）有限公司