原油环境样品中石油微生物的dna提取方法
【专利摘要】本发明涉及原油中提取DNA【技术领域】，是一种原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法；按下述方法进行：第一步，在离心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的离心管中加入100微升清洗缓冲液混合均匀得到混合液。本发明提取的DNA浓度较细菌DNA提取试剂盒提取的DNA浓度提高了50%，本发明提取的DNA的亮度明显高于细菌DNA提取试剂盒获得的DNA的亮度、获得的DNA的条带清晰、提取的DNA没有拖尾，说明本发明较细菌DNA提取试剂盒更易从原油中提取DNA，提取效率更高，更能准确全面真实的反映原油中微生物的种类和数量。
【专利说明】原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及原油中提取DNA【技术领域】，是一种原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]近年来随着人们对石油微生物的重视，尤其是微生物采油以及微生物气化研究的深入、以及对石油废水生物处理认识的提高，人们开始研究其中的微生物的组成分布以及规律，但研究微生物组成及其分布规律的一个重要前提是微生物样本的提取。然而，由于目前对于纯原油中微生物以及残油中的微生物的提取效率低下，而且提取效果不好，不能完全展现油中微生物的本来的组成和功能，使得从事该项环境微生物研究者十分头痛。用于环境样本中微生物DNA的提取难度较大，尤其是以高盐和污水中成分复杂的环境样本DNA的提取更加困难。目前，含油污水和污泥中DNA的制备方法多数为人工配置药品，采用溶菌酶，反复冻融结合CTAB法(溴化十六烷基三甲铵为主的DNA提取方法)或SDS法(十二烷基硫酸钠为主要溶液的DNA提取方法)提取样本中微生物的DNA，或用试剂盒制备，该法费用较高而且DNA提取效果不好，多为祢散的条带，或者得率低，无法进行PCR反应(聚合酶链式反应)；该法对于含有特殊的化学物质如油田污水会更加不容易提取，需要的时间较长，效果不好。目前现有的国内专利，并没有申请有关“原油”中微生物群落的微生物DNA的提取方法，同时对国内的专业期刊文献进行检索，国内参考文献:“王中华，梁静儿，杨建强，周君，李成华，李太武.原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究”中的原油微生物DNA的提取方法“为常规的试剂盒提取方法”，并非针对原油。目前没有针对原油提取方法的具体文献。这方面的针对性的“原油”中的微生物DNA的提取还未进行报道。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决石油中微生物DNA提取难度较大、DNA得率低、不能全面真实的反映环境样本中微生物的种类和数量的问题。
[0004]本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法进行:第一步，在离心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的离心管中加入100微升清洗缓冲液混合均匀得到混合液；第二步，将盛有混合液的离心管放置在细胞破碎仪中破碎40秒至60秒，然后在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均匀，在温度为37°C下水浴5小时至10小时；第四步，对水浴后的溶液用细菌DNA提取试剂盒进行提取，得到原油环境样品中石油微生物的DNA。
[0005]下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进:
上述清洗缓冲液按下述方法得到，按IOg Na2HPO4配Ig KH2HPO4,50g NaCl和1.5g KCl计，在Na2HPO4中加入KH2HP04、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到贮存液，调节贮存液的PH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。[0006]上述萃取清洗液按下述方法得到，将氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
[0007]上述离心管为1.5毫升的离心管。
[0008]本发明提取的DNA浓度较细菌DNA提取试剂盒提取的DNA浓度提高了 50%，本发明提取的DNA的亮度明显高于细菌DNA提取试剂盒获得的DNA的亮度、获得的DNA的条带清晰、提取的DNA没有拖尾，说明本发明较细菌DNA提取试剂盒更易从原油中提取DNA，提取效率更高，更能准确全面真实的反映原油中微生物的种类和数量。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]附图1为本发明原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法和细菌DNA提取试剂盒分别对原油提取后DNA的对照电泳图谱。
【具体实施方式】
[0010]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0011]实施例1，该原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法进行:第一步，在离心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的离心管中加入100微升清洗缓冲液混合均匀得到混合液；第二步，将盛有混合液的离心管放置在细胞破碎仪中破碎40秒至60秒，然后在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均匀，在温度为37°C下水浴5小时至10小时；第四步，对水浴后的溶液用细菌DNA提取试剂盒进行提取，得到原油环境样品中石油微生物的DNA。细菌DNA提取试剂盒为现有公知公用的设备；细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取和分析为现有公知公用的方法。细菌DNA提取试剂盒按照细菌基因组提取试剂盒(DP302)的方法操作(天根生化科技(北京)有限公司)进行提取和检测。
[0012]实施例2，该原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法进行:第一步，在离心管中加入10微升或50微升原油，然后在盛有原油的离心管中加入100微升清洗缓冲液混合均匀得到混合液；第二步，将盛有混合液的离心管放置在细胞破碎仪中破碎40秒或60秒，然后在转速为12000转/分钟或16000转/分钟的离心机中离心10分钟或15分钟，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升或300微升萃取清洗液，然后加入30微升或50微升的溶菌酶并混合均匀，在温度为37°C下水浴5小时或10小时；第四步，对水浴后的溶液用细菌DNA提取试剂盒进行提取，得到原油环境样品中石油微生物的DNA。
[0013]实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3中清洗缓冲液按下述方法得到，按IOgNa2HPO4 配 Ig KH2HPO4,50g NaCl 和 1.5g KCl 计，在 Na2HPO4 中加入 KH2HPO4' NaCl 和 KCl 配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到贮存液，调节贮存液的PH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。[0014]实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4中萃取清洗液按下述方法得到，将氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
[0015]实施例5，作为上述实施例的优化，实施例5中离心管为1.5毫升的离心管。
[0016]本发明实施例原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法和采用细菌DNA提取试剂盒的对比试验如下:
取适量新疆克拉玛依油田原油分成体积相同的两份原油样标为样品A和样品B，样品A直接采用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，样品B用本发明实施例原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法提取DNA ;样品A和样品B提取后用1%的凝胶电泳检测和DNA浓度测定，平均数据如表1所示。
[0017]表1
【权利要求】
1.一种原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于按下述方法进行:第一步，在离心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的离心管中加入100微升清洗缓冲液混合均匀得到混合液；第二步，将盛有混合液的离心管放置在细胞破碎仪中破碎40秒至60秒，然后在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均匀，在温度为37°C下水浴5小时至10小时；第四步，对水浴后的溶液用细菌DNA提取试剂盒进行提取，得到原油环境样品中石油微生物的 DNA。
2.根据权利要求1所述的原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于清洗缓冲液按下述方法得到，按IOg他2即04配18 KH2HPO4,50g NaCl和1.5g KCl计，在Na2HPO4中加入KH2HP04、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到贮存液，调节贮存液的PH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于萃取清洗液按下述方法得到，将氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
4.根据权利要求1或2所述的原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于离心管为1.5毫升的离心管。
5.根据权利要求3所述的原油环境样品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于离心管为1.5毫升的离心管。`
【文档编号】C12N15/10GK103667255SQ201310580492
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】聂春梅, 魏利, 陈爱华, 方新湘, 赵燕, 帕提古丽 申请人:克拉玛依市金山石油化工有限公司