一株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌pseudozymaaphidisCNm2012，保藏号为CCTCCNO：M2013563。该菌株分离自桑树叶面，是一种类酵母真菌，在土豆平板培养基上该菌的菌落颜色呈粉红色，中间部分平滑类似于酵母的菌落，但边缘长有菌丝；在萨氏液体培养基中培养7天，其菌体梭状，大小不一，胞内含有许多油滴状物质，随着生长长出菌丝；菌株的生长适温为20-30℃，pH6.5-7.5；菌株的18SrDNA序列1416bp，NCBI序列号为KF443200，28SrDNA序列627bp，序列号为KF443201，ITSrDNA序列784bp，序列号为KF443199。该菌可通过捕食桑白粉菌分生孢子对桑白粉病进行生物防治，并且对桑树以及家蚕没有致病性。
【专利说明】—株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病害生物防治领域，具体涉及一株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012。
【背景技术】
[0002]桑树是一种重要的经济作物，除了其叶可以用作饲养家蚕外，其果实可食用，以及用于提取花青素，其根、茎也可入药。桑白粉病是由子囊菌亚门核菌纲白粉菌目白粉菌科球针壳属真菌引起的一种桑树病害，受害桑叶因营养价值差，品质低劣，因而食用它的蚕体质变弱，容易诱发蚕病，导致蚕的茧量和茧层量少。桑白粉病的爆发对整个蚕桑行业造成巨大的经济损失，因此如何防治桑白粉病成了蚕桑产业关注的焦点。长期以来为了防治桑白粉病，大量使用化学药剂，不仅导致药物残留，还导致了耐药病原菌株的产生。因此寻找新的防治白粉病的方法具有十分重要的意义。生物防治方法是近年来研究的热点，生物防治主要是利用拮抗，竞争，或捕食(寄生或腐生)作用防治病原菌，但目前利用微生物制剂来防治桑树病害国内外尚未见相关研究报道。
【发明内容】
[0003]为了减少化学农药的使用对环境的污染及生物安全的影响，本发明提供一株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,通过捕食桑白粉菌分生孢子的作用形式来防治桑树白粉病。
[0004]本发明所述的菌株从桑树叶片表面分离，该菌株已于2013年11月10日保藏在湖北省武汉市武汉大学(邮编:430072，电话:027-68754052)中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，菌株保藏号为 CCTCC NO:M 2013563。
[0005]菌株接种于土豆固体培养基中，28°C培养4天，培养基上出现中间平滑似酵母，边缘长出菌丝的粉红色菌落，显微观察，菌体梭状，大小不一，菌体中央有油滴状物质，随着生长长出长短不一的菌丝。菌株18SrDNA序列1416bp,序列号为KF443200 ;28SrDNA序列627bp，序列号为KF443201 ;ITSrDNA序列784bp，序列号为KF443199。根据形态学和分子生物学特征，菌株被鉴定为pseudozyma aphidis ,菌株号CNm2012。
[0006]本发明所述的P1SewiZozjffla aphidis CNm2012的分离、纯化和保种方法是,将发现对桑白粉菌分生孢子有捕食作用的菌株涂布到含有青链霉素的土豆培养基上培养，挑取培养物在纯化培养基上纯化培养，培养条件:20-30°C，PH 6.5-7.5，然后纯化菌株转接到斜面进行保种。
[0007]本发明以捕食作用的方式来防治桑白粉病,试验表明菌株/zsewi/oiywa aphidisCNm2012对桑树及家蚕没有致病性。
[0008]【专利附图】
【附图说明】:
图 1、pseudozyim aphidis CNm2012 菌体的形态特征
28°C,在180r/min的转速下于萨氏液体培养基中摇床培养7天饱pseudozyma aphidisCNm2012菌体的显微结构图，刻度标尺为20 μ m。
[0009]图l、psoudozym3 aphidis CNm2012菌株基于ITS rDNA的系统进化分析树 'Upseudozyma属的14个种的ITS rDNA序列进行比对,依据临近法构建系统发育进
化树，括弧内为菌株ITS rDNA序列的序列号。
[0010]摩[IPseudozyma aphidis CNm2012菌株对桑白粉菌分生孢子的捕食作用
利用倒置显微镜对CNm2012菌株与桑白粉菌孢子混合液进行每小时跟踪拍摄所得的显微图，刻度标尺为20 μ m。
[0011]图4、以桑白粉菌为营养的aphidis CNm2012菌株的生长曲线图
用CNm2012菌株与不同浓度的桑白粉菌分生孢子共同培养，每隔12小时取样检验其0D600的吸光值(每组皆以各自浓度的桑白粉菌分生孢子悬液作为空白对照)。
[0012]图5、田间试验防治效果显微镜观察 在桑叶感染桑白粉菌早期以CNm2012菌株处理过的桑叶和对照桑叶在一周之后的表面显微形态，A是CNm2012菌株处理过的桑叶表面，B是对照桑叶表面，刻度标尺为100 μ m。
[0013]本发明的优点:本发明菌株/zsewi/ozjffla o^CNm2012的田间使用与化学农药相比不污染环境或产生药害，也不会导致耐药病原菌株的产生；菌株对生长条件的要求不苛刻，生长迅速，容易制备和生产菌剂；菌株可以显著抑制桑白粉菌病斑个数的增加，显著减少分生孢子的产生、扩散与感染传播，释放到环境可发挥持续的防治作用。
【具体实施方式】
[0014]实施例1 pseudozyma aphidis CNm2012 的分离和鉴定
1.菌株的分离与纯化
(I)分离。培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，青链霉素3g，单蒸水1L。将在观察白粉菌分生孢子发芽过程中，发现的对其有捕食作用的菌株涂布到培养基上28°C恒温培养。
[0015](2)纯化。萨氏培养基:葡萄糖40g,酵母膏IOg,蛋白胨IOg,琼脂粉36g,单蒸水1000ml, PH 6.5-7.5。挑取培养物在该培养基上划线接种菌株，28°C恒温培养。
[0016](3)保种。土豆培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，单蒸水1L。将纯化的菌株在该培养基上斜面保存。
[0017]2.菌株的形态学和分子生物学特征 (I)形态学特征
Pseudozyma aphidis CNm2012的菌落常常是二态的:中间部分呈粉红色的浆糊状或者奶油状，而边缘则有呈放射状生长的菌丝。它的生长初期像酵母:两端芽殖，常常合轴繁殖。菌丝透明有隔，在隔附近梗状旁枝的出现使得芽分生孢子由纺锤形和椭圆形变成圆柱状，常常会出现短的气生菌丝链，有的气生菌丝会有分支，有的则没有，气生菌丝链都是由纺锤形的枝分生孢子组成。气生菌丝的出现常常使得其菌落出现绒毛，或者看起来像披上了一层白霜。随着菌株的老龄化，菌落看起来具有马蹄纹形状。
[0018](2)分子生物学特征
纯化菌株接种在萨氏液体培养基(葡萄糖4g,酵母膏Ig,蛋白胨lg，单蒸水100ml,PH6.5-7.5) Φ, 20-30°C, 150-200r/min,振荡培养 10-20 天。接下来 5000 转离心 5 分钟，丢弃上清液，然后再用无菌水冲洗三次，冲洗方法是重悬、离心、弃液。然后于烘箱中40°C烘10-15小时，再用液氮将其研碎，提取菌体基因组。
[0019]ITS引物对为
ITSl (5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')
ITS4 (5; -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，
26S引物对为
NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA-3’) NL-4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)，
18S引物对为
NSl (5’ - GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3’)
NS6 (5’ — GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 3’)
用PCR的方法进行扩增，获得ITS rDNA序列784bp、18S rDNA序列1416bp，28S rDNA序列627bp。在NCBI中应用BLAST软件对这三个序列进行比对，并基于ITSrDNA构建进化树，依据邻近法构建的系统发育树显示该菌株与聚为一枝(图2)。
[0020]依据菌株的形态学和分子生物学特征，菌株CNm2012被鉴定为pseudozymaaphidisο
[0021]实施例2菌株P1SewiZozjffla aphidis CNm2012对桑白粉菌分生孢子捕食作用的显微观察
称取马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂9g，单蒸水500ml，PH6.5-7.5，将配置好的培养基置入高压锅中120°C灭菌30分钟。将菌株CNm2012在该PDA板上进行活化。然后用500ml的三角瓶对菌株进行发酵，发酵所用的培养基是萨氏培养基，其配方是:葡萄糖4g，酵母膏lg，蛋白胨lg，单蒸水100ml,PH6.5-7.5。发酵条件是:温度20_30°C，180r/min，发酵4天。将发酵好的菌液1000转离心5分钟去除上清液，再用无菌水冲洗三次，冲洗方法是重悬、离心、弃液。将上述步骤所得到的菌体与白粉菌分生孢子混合，重悬于无菌水中，对其进行跟踪观察(图3)。
[0022]根据对该菌株与桑白粉菌分生孢子混合在一起的跟踪观察发现，白粉菌分生孢子的出现吸引了菌株aphidis CNm2012,该菌株围绕着白粉菌分生孢子生长,并且利用其进行繁殖。
[0023]实施例3基于桑白粉菌为营养的aphidis CNm2012菌株的生长曲线测定
将CNm2012菌株分别与不同浓度的桑白粉菌分生孢子混合成100ml的悬液，悬液中包含有浓度为 105cfu/ml 的 CNm2012 菌株，浓度分别为 6 X IO2 cfu/ml、6X 103cfu/ml、6X IO4cfu/ml的桑白粉菌分生孢子。将混合液置于28°C，180r/min的摇床中培养，每隔12小时取样检验其0D600的吸光值(每组皆以各自浓度的桑白粉菌分生孢子悬液作为空白对照)。试验设置105cfu/ml浓度的CNm2012水溶液为阴性对照。结果显示:CNm2012菌株的吸光光度值随着桑白粉菌分生孢子浓度的增加而增加(表1),表明aphidis CNm2012菌株确实将桑白粉菌作为了营养进行了捕食(图4)。
[0024]表1.CNm2012菌株以桑白粉菌为营养生长的0D600值
【权利要求】
1. 一株对桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,其保藏号为 CCTCC NO: M 2013563。
【文档编号】C12N1/14GK103642699SQ201310608814
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】邱欣, 汪静杰, 张琳, 冯丽春, 段正巧, 刘艳萍, 陈倩茜, 万永继 申请人:西南大学