一种两栖动物非伤害性取样dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种两栖动物非伤害性样品采集DNA提取方法，通过剪去两栖动物蹼和/或趾并进行DNA提取。采用本发明的方法，提取快速而且所提取的DNA纯度高的两栖动物，对两栖动物没有伤害，不影响其进一步繁殖。
【专利说明】一种两栖动物非伤害性取样DNA提取方法
发明领域
[0001]本发明涉及一种分子生物学方法，具体是发明了一种DNA提取的具体方法，用于非伤害性取样后提取(有尾目和无尾目)两栖动物DNA。
【背景技术】
[0002]两栖动物作为低等四足动物，现有种类4000余种，但其种类和数量远不如其它的陆生脊椎动物，在3个目中，无尾目种类最为繁多，分布最广泛。两栖动物虽然也能适应多种生活环境，但是其适应力远不如更高等的其它陆生脊椎动物，既不能适应海洋的生活环境，也不能生活在极端干旱的环境中，在寒冷和酷热的季节则需要冬眠或者夏蜇。两栖动物作为生态系统中的重要组成部分，因生活环境的丧失、环境的污染、过度猎捕等使其种群数量急剧减少。目前，涉及两栖动物的分子生态学与保护遗传学方面的研究已成为现代生物学研究的热点之一，作为其研究基础的DNA提取质量成为影响实验结果的一个重要因素。[0003]常用的获得动物DNA的取样方法有3种，即伤害性取样、非伤害性取样和非损伤性取样。伤害性取样是指通过获得研究对象的新鲜肌肉、肝脏等组织提取DNA，此取样方式对于物种的破坏性较大，特别是对于珍稀濒危物种而言，其破坏是毁灭性的。非伤害性取样主要通过采集动物毛发、羽毛、耳、尾、趾或抽取动物的血液等来提取DNA。非损伤性取样是在不触及或不伤害动物本身的前提下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣等样品进行遗传分析的取样方法，该方法不会对动物本身产生伤害，但却很难获得完整的DNA。
[0004]一直以来，对于两栖动物遗传多样性等方面的研究多采用伤害性取样，往往导致动物死亡，不利于对其进行保护；采用非伤害性取样或非损伤性取样提取动物DNA的提取研究较多，但对两栖类动物采用非伤害性取样或非损伤性取样提取DNA的研究较少。因此，非常有必要探讨两栖类非伤害性取样DNA提取的可行性。
【发明内容】
[0005]本发明是为了解决两栖动物样品DNA提取质量的问题，提供一种操作简单，提取快速而且所提取的DNA纯度高的两栖动物(主要包括有尾目和无尾目两栖动物)非伤害性DNA提取方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0006]本发明一方面涉及两栖动物(主要包括有尾目和无尾目两栖动物)非伤害性样品采集DNA提取方法，其特征在于包括步骤:
[0007](I)取活有尾目或无尾目两栖动物蹼和/或趾，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；
[0008](2)加入I % -3%的P -巯基乙醇溶液，混匀后60_70°C水浴0.5-lh,每隔3-5分钟取出摇匀一次；
[0009](3) 10000-15000rpm离心3_7min,离心后，移出上清于另一无菌离心管中，弃沉淀；[0010](4)向上清中加入等体积的按体积比20-30:1的氯仿:异戊醇的混合溶剂，混匀后,8000-12000rpm离心5_15min,取上清至另一无菌离心管中；
[0011](5)加入等体积的氯仿,混匀后8000-12000rpm离心5_15min,再取上清；
[0012](6)向上清中加入0.8-1.2倍体积的2-4M NaAC溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后_18°C以下放置30min以上；
[0013](7) 10000-15000rpm离心3_7min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；
[0014](8)用70-80%的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE (TE是一种弱碱性的缓冲液，对DNA的碱基有保护性，提取好的DNA主要放在TE缓冲液是保存；其配方为:IOmmoI/L Tris-HCl (pH8.0)和 ImmoI/L EDTA(pH8.0))中，加 RNase A，37°C消化20_40min，之后于_20°C保存。
[0015]在本发明的一个优选的实施方式中，其特征在于所述方法还包括DNA的扩增步骤，所述步骤为以步骤⑶所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物Pf:5’ -CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 扩增。
[0016]在本发明的一个优选的实施方式中，其特征在于有蹼的两栖动物使用手术剪无伤害的剪取其展开的蹼，无蹼的两栖动物使用手术剪无伤害的剪取其趾端。
[0017]在本发明的一个优选的实施方式中，所述的匀浆液的特征在于按以下配方配制:IOOmM Tris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA、2% CTAB、I %-4% PVP-40，使用前在 60_70°C下预热。
[0018]在本发明的一个优选的实施方式中，其特征在于所述的(6-巯基乙醇溶液的加入量为总体积的1% _3%，并单独加到悬液中。
[0019]在本发明的一个优选实施方式中，所述的两栖动物选自大鲷、蛾眉树娃。
[0020]采用本发明的方法，提取快速而且所提取的DNA纯度高的两栖动物，对两栖动物没有伤害，不影响其进一步繁殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1:电泳分析结果照片。
【具体实施方式】
[0022]a.取采自某养殖场的大鲵肌肉、蹼或趾各30mg，剪碎后置于匀浆器中，加入500 u L匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置1.5或2ml离心管中；匀浆液的特征在于按以下配方配制:IOOmM Tris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA,2% CTABU % -4% PVP-40，使用前须在60-70°C下预热。
[0023]b.加入I % -3%的P -巯基乙醇溶液，混匀后60_70°C水浴0.5-lh,每隔几分钟取出摇匀一次；(6-巯基乙醇溶液的特征在于:其为总体积的1% _3%，且要单独加到悬液中；
[0024]c.12000rpm离心5min,离心后，移出上清于另一无菌1.5或2ml离心管中，弃沉淀；
[0025]d.向上清中加入等体积的按体积比24:1的氯仿:异戊醇，混匀后，10，OOOrpm离心IOmin,取上清至另一无菌1.5或2ml离心管中；[0026]e.加入等体积的氯仿,混匀后于10, OOOrpm离心IOmin,再取上清；
[0027]f.向上清中加入0.1倍体积的3M NaAC,混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后_20°C放置30min以上；
[0028]g.12000rpm离心5min,弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；
[0029]h.用75 %的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于100 y L TE中，加RNase A至终浓度为20ii g/mL，37°C消化30min，之后于_20°C保存，备用；
[0030]1.以步骤⑶所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物Pf:5’ -CGCCTGITTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 扩增出 16S rDNA 特异性条带并进行电泳检测。
[0031]电泳分析结果如图1所示，试验结果表明:大鲵和蛾眉树蛙的蹼和趾样本与肌肉样本一样均能获得明显的PCR扩增产物，且产物条带清晰，产量高，能够很好地满足分子生物学遗传分析的需要。图中I为大鲵肌肉、蹼和趾样品，2为蛾眉树蛙肌肉、蹼和趾样品。
[0032]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的`保护范围为准。
【权利要求】
1.一种两栖动物非伤害性样品采集DNA提取方法，其特征在于包括步骤: (1)取活有尾目或无尾目两栖动物蹼和/或趾，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中； (2)加入I% -3%的P -巯基乙醇溶液，混匀后60-70°C水浴0.5-lh，每隔3_5分钟取出摇匀一次； (3)10000-15000rpm离心3_7min,离心后,移出上清于另一无菌离心管中，弃沉淀； (4)向上清中加入等体积的按体积比20-30:1的氯仿:异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5_15min，取上清至另一无菌离心管中； (5)加入等体积的氯仿,混匀后8000-12000rpm离心5_15min,再取上清； (6)向上清中加入0.8-1.2倍体积的2-4M NaAC溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后_18°C以下放置30min以上； (7)10000-15000rpm离心3_7min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干； (8)用70-80%的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE (是什么)中，加RNaseA，37°C消化20-40min，之后于_20°C保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括DNA的扩增步骤，所述步骤为以步 骤⑶所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物Pf:5，-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’ 和 Pr:5’ -CCGGGCTGAACTCAGATCACGT-3’ 扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于有蹼的两栖动物使用手术剪无伤害的剪取其展开的蹼，无蹼的两栖动物使用手术剪无伤害的剪取其趾端。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的匀浆液的特征在于按以下配方配制:100mMTris-HClU.4M NaCl、20mM EDTA,2% CTABU % ~4% PVP-40，使用前在 60_70°C下预热。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(6-巯基乙醇溶液的加入量为总体积的1% _3%，并单独加到悬液中。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述的两栖动物选自大鲵、蛾眉树蛙(可以补充其它适用的动物)。
【文档编号】C12N15/10GK103614372SQ201310612204
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】徐敬明, 樊汶樵 申请人:重庆文理学院