一种菠萝基因表达的芯片检测方法
【专利摘要】本发明提供一种菠萝基因表达的芯片检测方法：提取菠萝不同组织、不同时期的RNA，收集了整个生育期的基因表达信息；将收集到的RNA混合进行测序，获得序列信息；根据获得的序列信息，设计芯片探针并点制芯片；最后将标记好的实验样品RNA与芯片杂交，高通量地检测表达的RNA。以后根据自身实验需要可以用芯片检测自己的样品获得高通量的基因表达的信息。本发明中的芯片包含了菠萝不同组织和不同发育时期基因表达的所有信息即共包括80955个基因，用该芯片杂交一次可以同时检测出上述8万多个基因的表达情况，方法简便，效率非常高，实验稳定，同时价格便宜。
【专利说明】一种菠萝基因表达的芯片检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种菠萝基因表达的芯片检测方法【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]菠萝是重要的热带水果，是行内专家研究的热点。但是菠萝基因组序列尚不清楚，基因表达的检测主要靠转录组测序之后，再进行表达谱分析，或者逐一对单个基因进行定量分析。目前这些技术操作繁琐，效率比较低，重复性较差，缺乏高通量的便捷检测技术。
【发明内容】
:
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种菠萝基因表达的芯片检测方法。
[0004]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明采用以下技术方案:
[0005]一种菠萝基因表达的芯片检测方法，包括以下步骤:
[0006](1)提取菠萝根、茎、叶片、花、果实、顶芽等不同组织以及营养生长、生殖转化和生殖发育不同时期的RNA，收集了整个生育期的基因表达信息； [0007](2)将收集到的RNA等量混合用Illumina Solexa Hiseq2000进行测序,获得了81129条unique基因序列；
[0008](3)根据获得的序列信息，利用Agilent的在线探针设计软件e-array进行芯片探针设计，设计格式为4*180K，探针长度为60mer，共有80955条unique基因序列设计成功，每条序列有两个重复探针，芯片上还包含了 4854条Agilent质控探针，将设计好的探针设计方案提交Agilent公司进行芯片生产。
[0009](4)将实验样品RNA被突光标记后与芯片杂交，通过扫描突光信号，归一化处理，高通量地检测表达的RNA ；
[0010](5)根据自身实验需要可以用芯片检测菠萝RNA样品，获得高通量的基因表达的信息。
[0011]进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S/18S约2倍。
[0012]进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据要大于5G以上，质控标准要大于等于Q20以上。
[0013]进一步地，所述的步骤(3)中，每个芯片上有4个相同的点阵，每个点阵最多包含有180880个探针，探针长度为60个碱基左右。
[0014]进一步地，所述的步骤④中，筛选标准为:p-value < 5%,同时Absolute Foldchange在2.0倍以上，为有效差异表达基因。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本芯片包含了菠萝不同组织和不同发育时期基因表达的所有信息即共包括80955个基因，用该芯片杂交一次可以同时检测出上述8万多个基因的表达情况，方法简便，效率非常高，实验稳定，同时价格便宜。【专利附图】
【附图说明】:
[0016]图1是本发明方法流程图。
[0017]图2是本发明原理解释图。
【具体实施方式】:
[0018]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步描述:
[0019]图1是本发明方法流程图。一种菠萝基因表达的芯片检测方法，包括以下步骤:
[0020](1)提取菠萝根、茎、叶片、花、果实、顶芽等不同组织以及营养生长、生殖转化和生殖发育不同时期的RNA，收集了整个生育期的基因表达信息；
[0021](2)将收集到的RNA等量混合用Illumina Solexa Hiseq2000进行测序,获得了81129条unique基因序列；
[0022](3)根据获得的序列信息，利用Agi lent的在线探针设计软件e-array进行芯片探针设计，设计格式为4*180K，探针长度为60mer，共有80955条unique基因序列设计成功，每条序列有两个重复探针，芯片上还包含了 4854条Agilent质控探针，将设计好的探针设计方案提交Agilent公司进行芯片生产。
[0023](4)将实验样品RNA被突光标记后与芯片杂交，通过扫描突光信号，归一化处理，高通量地检测表达的R NA ；
[0024](5)根据自身实验需要可以用芯片检测菠萝RNA样品，获得高通量的基因表达的信息。
[0025]进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S/18S约2倍。
[0026]进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据要大于5G以上，质控标准要大于等于Q20以上。
[0027]进一步地，所述的步骤(3)中，每个芯片上有4个相同的点阵，每个点阵最多包含有180880个探针，探针长度为60个碱基左右。
[0028]进一步地，所述的步骤④中，筛选标准为:p-value < 5%,同时Absolute Foldchange在2.0倍以上，为有效差异表达基因。
[0029]图2是本发明原理解释图。本发明的原理是:基于转录组的基因表达芯片检测技术是利用碱基互补配对原理即在常温下和中性条件下形成双链DNA分子，但在高温、碱性或有机溶剂等条件下，双螺旋之间的氢键断裂，双螺旋解开，形成单链分子。根据转录组测序获得的序列设计探针(60个碱基长度)，将许多该长度的核苷酸序列(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内。同时将待测样品RNA通过RT-PCR进行荧光标记，然后将本标记好的样品同芯片进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因表达检测。基因芯片能够同时分析成千上万个基因的表达，将许多不连续的分析过程集成于玻璃介质上，使这些分析过程连续化、微型化、集成化和自动化。
[0030]本发明也可以通过菠萝全基因组测序，获得基因组序列，进行基因预测，根据预测的基因序列，设计探针，点制芯片，用于菠萝基因表达的高通量筛选。还可以用该方法对其它物种的基因表达进行类似的基因表达的高通量分析。[0031]最后应当说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照具体实施例对本发明作了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.一种菠萝基因表达的芯片检测方法，其特征在于，它包括如下步骤:(1)提取菠萝根、茎、叶片、花、果实、顶芽等不同组织以及营养生长、生殖转化和生殖发育不同时期的RNA，收集了整个生育期的基因表达信息；(2)将收集到的RNA等量混合用IlluminaSolexa Hiseq2000进行测序，获得了 81129条unique基因序列；(3)根据获得的序列信息，利用Agilent的在线探针设计软件e-array进行芯片探针设计，设计格式为4*180K，探针长度为60mer，共有80955条unique基因序列设计成功，每条序列有两个重复探针，芯片上还包含了 4854条Agilent质控探针，将设计好的探针设计方案提交Agilent公司进行芯片生产；(4)将实验样品RNA被荧光标记后与芯片杂交，通过扫描荧光信号，归一化处理，高通量地检测表达的RNA ；(5)根据自身实验需要可以用芯片检测菠萝RNA样品，获得高通量的基因表达的信息。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝基因表达的芯片检测方法，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S/18S约2倍。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝基因表达的芯片检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，RNA测序数据要大于5G以上，质控标准要大于等于Q20以上。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝基因表达的芯片检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，每个芯片上有4个相同的点阵，每个点阵最多包含有180880个探针，探针长度为60个碱基左右。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝基因表达的芯片检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，筛选标准为:p_value < 5%,同时Absolute Fold change在2.0倍以上，为有效差异表达基因。
【文档编号】C12Q1/68GK103642909SQ201310612223
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】张鲁斌, 贾志伟, 常金梅, 谷会, 洪克前, 弓德强 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所