G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及G418抗性标记的农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用，以G418的抗性为木霉抗性筛选标记。该农杆菌介导的木霉遗传转化方法包括将G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体p1300连接成p1300-neo载体；农杆菌菌株活化并培养至OD600值为0.3～0.6，并用15～25mmol/L?CaCl2重悬菌体，制备农杆菌感受态细胞；将p1300-neo载体与农杆菌感受态细胞混匀，35～40℃保温至少3min，用LB培养基在25～35℃培养，再用含卡那霉素和利福平的YEB培养基培养并筛选出重组农杆菌；将处于对数生长期且OD660值为0.6～0.8的活化的重组农杆菌菌液与木霉分生孢子悬液混匀并诱导培养，再用含G418的M-100培养基在25～30℃培养并筛选出抗G418的木霉。本发明为木霉菌增加了一种新的抗性选择标记，为研究木霉的基因功能带来了巨大方便，而且价格便宜。
【专利说明】G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传工程领域，具体来说涉及一种G418抗性标记在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用。
【背景技术】
[0002]木霉菌广泛存在于土壤环境中，是土壤微生物的重要类群，也见于植物残体及动物粪便上，在植物根围、叶围、种子及球茎等生态环境中也大量存在。自从上世纪30年代以来，这类有益微生物已广泛用于植物病害的生物防治、纤维素酶的生产、生物修复功能。木霉能够降解氰化物、农药、甲醛、柴油、酚类及吸附重金属等。
[0003]农杆菌介导的遗传转化法为木霉菌的遗传改良和功能基因研究提供了有效手段。在木霉菌的遗传转化体系中，最常用的选择标记基因是潮霉素抗性基因。通过潮霉素抗性标记可以筛选获得木霉突变体菌株，进一步进行木霉菌基因功能的研究，更好地发挥木霉在生物防治、环境修复以及工业产品生产中的应用。但在研究木霉基因功能时，往往需要对野生木霉进行基因敲除实验，在此基础上对敲除突变体进行基因功能互补验证实验。此时，仅仅有一种抗性选择标记往往不能满足要求，必须要有新的抗性选择标记才可以进行遗传转化子的筛选。长期以来，用于木霉菌遗传转化的选择性标记仅有潮霉素B抗性标记，缺乏其它有效的抗性选择标记。因此，扩展木霉菌显性筛选标记具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的 第一个目的是提供一种G418在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用方法，该应用方法是以G418的抗性为木霉抗性筛选标记，以解决木霉菌遗传转化的选择性标记不足的问题。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种新的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，以解决通常通过PEG介导的原生质体转化，步骤比较繁琐的问题。
[0006]实现上述第二个发明目的的技术方案为:所述农杆菌介导的木霉遗传转化方法包括
[0007](1)将从？31034质粒中回收的6418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体？1300连接，构建成pl300-neo载体；
[0008](2)农杆菌菌株用LB培养基活化并培养至0D_值为0.3~0.6，收集菌体，并用15~25mmol/L CaCl2重悬菌体，制备农杆菌感受态细胞；
[0009](3)将(I)中pl300_neo载体与(2)中农杆菌感受态细胞混匀，35~40°C保温至少3min，用LB培养基在25~35°C培养，再用含卡那霉素和利福平的YEB培养基培养并筛选出重组农杆菌并通过PCR确认含G418抗性基因；
[0010](4)将处于对数生长期且OD66tl值为0.6~0.8的活化的重组农杆菌菌液与木霉分生孢子悬液混匀并诱导培养，再用含G418的M-100培养基在25~30°C培养并筛选出抗G418的木霉。[0011]该农杆菌介导的木霉遗传转化方法与现有农杆菌介导的木霉遗传转化方法的区别在于以G418的抗性为筛选标记。
[0012]其中，
[0013]构建pl300_neo载体时用Xba I酶切质粒pSM334和载体pl300。
[0014]木霉分生孢子悬液通过将木霉菌株接种于PDA培养基，24~30°C光照培养木霉菌，用无菌生理盐水洗下木霉分生孢子得到。
[0015]活化的重组农杆菌菌液通过将农杆菌菌株接种到LB液体培养基中培养，再用诱导培养基培养农杆菌至OD66tl达0.6~0.8得到。其中，LB液体培养基中可含卡那霉素和链霉素；诱导培养基中含乙酰丁香酮和葡萄糖。
[0016]步骤(2)中的LB培养基中还可以含有福利平；步骤(4)中M-100培养基中可含头
孢霉素。
[0017]上述木霉为野生型深绿木霉。
[0018]本发明的第三个目的是提供一种农杆菌介导的木霉遗传转化体系，该体系与现有木霉遗传转化体系的区别在于:以从PSM334质粒中回收的G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体pl300连接成的pl300-neo为载体。
[0019]本发明的优点在于:木霉菌具有非常重要的生物工程价值，在工业、农业和环境修复领域得到广泛应用。在研究木霉的基因功能时，往往需要对野生木霉进行基因敲除实验，在此基础上对敲除突变体进行基因功能互补验证实验。此时，仅仅有一种抗性选择标记不能满足需要，必须要有新的抗性`选择标记才可以进行遗传转化子的筛选，但在木霉中除了潮霉素抗性选择标记外一直未找到其他合适的抗生素抗性选择标记。本发明首次以G418作为木霉的抗性选择标记，并经过了严格的实验论证，为木霉菌增加了一种新的抗性选择标记，这为木霉的基因功能研究带来了巨大方便。Pl300-neo载体的构建，改变了以往G418作为显性筛选标记在木霉菌中一直没有得到成功和广泛应用的状况，为木霉菌突变体的筛选和基因功能的研究等遗传操作提供一个经济又比较高效的工具。该载体也可以广泛应用于其他丝状真菌的遗传研究中去。
[0020]此外，潮霉素价格昂贵，每克价格大约为5000元，而G418的价格大约仅为潮霉素的十分之一，本发明也表明以G418作为抗性筛选标记时，其在PDA培养基中的使用浓度约为25 μ g/mL,远低于潮霉素通常250 μ g/mL的使用浓度。因此以G418作为木霉的抗性筛选标记可以大大节约成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1深绿木霉T23对G418的敏感性测试结果，图中上排从左到右G418浓度依次为分别为O μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL,下排从左到右G418浓度依次为分别为15 μ g/mL、20 μ g/mL、25 μ g/mL。
[0022]图2 pl300_neo质粒的酶切验证图，其中M为DNA Marker ;I为pl300_neo ;2为Xba I 酶切 P1300 ;3 为 EcoR I 酶切 pl300_neo ;4 为 Xba I 酶切 pl300_neo。
[0023]图3 G418抗性基因分析图
【具体实施方式】[0024]下面结合附图和【专利附图】
【附图说明】解释本发明的【具体实施方式】
[0025]实施例中涉及的主要材料和试剂来源
[0026]木霉:野生型深绿木霉T23，来源于阜阳师范学院生命科学院。
[0027]质粒pl300:将质粒pCAMBIA1300中潮霉素抗性基因片段酶切去除改造而成，来源于阜阳师范学院生命科学院。
[0028]农杆菌:根癌农杆菌AGL-1，来源于上海交通大学生命科学技术学院。
[0029]质粒pSM334:来源于中国农科院。
[0030]限制性内切酶Xba I和EcoR 1:来源于Fermentas生物公司。
[0031]G418:来源于德国MERCK公司。
[0032]实施例中涉及的主要试剂、培养基的配制方法
[0033]诱导培养基:1XMM Salts，10mmol/L葡萄糖，0.5%甘油，湿热灭菌，冷却到50°C后,加入40mmol/L4-吗啉乙磺酸。
[0034]其中IXMM Salts:称取 KH2P043.625g，K2HP045.125g，NaCl0.375g，MgSO4 7H201.250g, CaCl2.2H200.165g, FeSO4 7H200.0062g, (NH4)2SO4L 250g,加水定容至lOOOmL，稀释 2.5 倍。
[0035]M-100 培养基:葡萄糖 10g，硝酸钾(KNO3) 3g，M-100 盐溶液(Salt Solution)62.5mL，琼脂粉1.5g，重蒸水定容到lOOOmL，湿热灭菌，冷却到50°C左右加入相应体积的头孢霉素和潮霉素母液以达到所需的终浓度。
[0036]其中M-100盐溶液(Salt Solution):称取磷酸二氢钾(KH2PO4) 16g，硫酸钠(Na2SO4) 4g，氯化钾(KCl) 8g，七水合硫酸镁(MgSO4 7H20) 2g，氯化钙(CaCl2) lg,M-100 痕量盐溶液(Trace Element Solution) 8mL,重蒸水定容到1000mL。其中，M-100痕量盐溶液(Trace Element Solution):称取亚磷酸(H3PO3) 30mg,四水合氯化猛(MnCl2'4H20) 70mg,氯化锌(ZnCl2) 200mg，钥酸钠(Na2MoO4 2H20) 20mg,六水合氯化铁(FeCl3 6H20) 50mg,五水硫酸铜(CuSO4 5H20) 200mg，重蒸水定容到 500mL。
[0037]实施例一
[0038]1.G418抗生素在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用
[0039]由于G418抗性选择基因在木霉上是首次使用，必须进行敏感性测试来确定木霉对G418是否敏感，以及筛选培养基中G418的合适使用浓度。结果表明:随着PDA培养基中G418浓度的升高，野生木霉生长受到的抑制效果明显增强，在G418浓度为25 μ g/mL的PDA平板上，野生型深绿木霉T23菌株培养90h未见明显生长迹象，生长被完全抑制。表明25 μ g/mL的G418浓度能有效地抑制野生型深绿木霉T23的生长，因此可以G418抗生素的抗性为木霉抗性筛选标记。为有效地进行深绿木霉的遗传转化筛选，选择25 μ g/mL的G418浓度作为遗传转化的筛选浓度。
[0040]2.农杆菌介导的木霉遗传转化方法
[0041](I)构建 pl300_neo 载体
[0042]用Xba I酶切质粒PSM334，回收大小约为2.1kb的G418抗性基因片段，与经过Xba I酶切，并进行去磷酸化的载体pl300连接，构建成pl300-neo载体。构建成的pl300-neo载体通过EcoR I和Xba I酶切，分别与对照质粒pl300相比，发现酶切后的两DNA片段大小相差在2kb左右(图2)，与理论预期一致，表明大小约为2.1kb的G418抗性基因片段已经连接到P1300质粒上。
[0043](2)制备农杆菌感受态细胞
[0044]将根癌农杆菌菌株在LB平板上活化，将活化的根癌农杆菌菌液接种到含福利平的LB液体培养基，29°C培养至OD6tltl值为0.6，预冷后离心收集菌体，弃上清，再用预冷的15mmol/L CaCl2 重悬沉淀。
[0045](3) pl300-neo载体转化农杆菌
[0046]将pl300_neo载体加到溶化的根癌农杆菌感受态细胞中，混匀；混匀液依次冰浴30min、液氮速冻2min、37°C保温3min、冰浴2min后，加入LB液体培养基在28°C培养6h后，取菌液涂布于含卡那霉素和利福平的YEB选择平板上，28°C倒置培养，选择重组农杆菌并通过PCR确认含G418抗性基因。
[0047](4)重组农杆菌的活化培养
[0048]将重组农杆菌菌株接种到含卡那霉素和链霉素的LB的液体培养基中，29°C培养，再用含乙酰丁香酮和葡萄糖的诱导培养基29°C培养至OD66tl达0.6。
[0049](5)制备深绿木霉分生孢子悬液
[0050]野生型深绿木霉T23接种于马铃薯葡糖糖琼脂培养基(PDA培养基)，28°C光照培养5天，用无菌生理盐水洗下分生孢子，血球计数板计数，调整分生孢子浓度为IO7个/mL。
[0051](6)农杆菌介 导的深绿木霉遗传转化
[0052]首先将玻璃纸覆盖在含乙酰丁香酮和葡萄糖的诱导培养基上，再混匀活化好的重组农杆菌和野生型深绿木霉分生孢子悬液，然后将混匀液涂布到玻璃纸上，25°C黑暗培养2天，将玻璃纸转移到含G418和头孢霉素的M-100平板上，28°C培养3天，筛选出抗G418的野生型深绿木霉转化子。
[0053]3.农杆菌介导的木霉遗传转化体系
[0054]筛选出抗G418的野生型深绿木霉转化子后，再将其转至含有25 μ g/mL的G418的PDA上进行二次筛选，然后在PDA上继代培养7代后，仍能在含25 μ g/mL G418的PDA上正常生长的转化子确认为是稳定的转化子。
[0055]根据G418抗性基因序列设计引物对pl/p2，通过PCR扩增来进一步鉴定是否为转化子，其中引物对P 1/ρ2分别为，
[0056]P1:ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGC
[0057]p2:TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
[0058]通过ATMT获得的转化子经过连续多代的继代后仍能在含G418的抗性平板上生长。经PCR检测，转化子均能扩增出G418抗性基因片段(如图3所示)，表明为阳性转化子。
[0059]因此可以建立一种新的农杆菌介导的木霉遗传转化体系，该遗传转化体系与现有木霉遗传转化体系的区别在于以G418抗生素的抗性为筛选标记。
[0060]实施例二
[0061]除以下技术特征之外，其它技术特征均与实施例1相同。
[0062](2)中活化的农杆菌菌液接种到含福利平的LB液体培养基，29°C培养至0D_值为
0.3,预冷后离心收集菌体,弃上清,再用预冷的20mmol/L CaCl2重悬沉淀。
[0063](3)中pl300-neo载体和农杆菌感受态细胞混匀液35°C保温4min ;加入LB液体培养基中后在25°C培养4h后，取菌液涂布于含卡那霉素和利福平的YEB选择平板上。[0064](4)中重组农杆菌菌株接种到LB液体培养基中，用诱导培养基培养至OD66tl达0.8。
[0065](6)中玻璃纸转移到含G418和头孢霉素的M-100平板上，25°C培养7天，并筛选出抗G418的野生型深绿木霉转化子。
[0066]实施例2
[0067]除以下技术特征之外，其它技术特征均与实施例1相同。
[0068](2)中活化的根癌农杆菌菌液接种到含福利平的LB液体培养基，29°C培养至0D_值为0.5，预冷后离心收集菌体，弃上清，再用预冷的25mmol/L CaCl2重悬沉淀。
[0069](3)中pl300_neo载体和农杆菌感受态细胞混匀液40°C保温5min ;加入LB液体培养基中后在35°C培养5h后，取菌液涂布于含G418的YEB选择平板上。
[0070](4)中重组农杆菌菌株接种到LB液体培养基中，用诱导培养基培养至OD66tl达0.7。
[0071](6)中玻璃纸转移到含G418和头孢霉素的M-100平板上，30°C培养7天，并筛选出抗G418的野生型深绿木霉转 化子。
【权利要求】
1.一种G418在农杆菌介导的木霉遗传转化中的应用，其特征是:以G418的抗性为木霉抗性筛选标记。
2.一种农杆菌介导的木霉遗传转化方法，包括 (1)将筛选标记基因与经过酶切并去磷酸化的载体P1300连接，构建成pl300-neo载体； (2)将农杆菌用LB培养基活化并培养至0D_值为0.3~0.6，收集菌体，并用15~25mmol/L CaCl2重悬所述菌体，制备农杆菌感受态细胞； (3)将步骤(1)中所述pl300-neo载体与步骤(2)所述农杆菌感受态细胞混匀，在35~40°C保温至少3min，再用LB培养基在25~35°C培养后，然后用含卡那霉素和利福平的YEB培养基培养并筛选出重组农杆菌并通过PCR确定含筛选标记基因； (4)将处于对数生长期且OD66tl值为0.6~0.8的活化的所述重组农杆菌菌液与木霉的分生孢子悬液混匀并诱导培养，再用M-100培养基在25~30°C培养并筛选出带有筛选标记基因的木霉， 其特征在于:所述筛选标记为G418抗性，所述筛选标记基因为从pSM334质粒中回收的G418抗性基因。
3.如权利要求2所述的农 杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于:所述木霉分生孢子悬液是通过将木霉接种到PDA培养基，24~30°C光照培养木霉菌，再用无菌生理盐水洗下木霉分生孢子得到。
4.如权利要求2所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于:所述活化的重组农杆菌菌液是将所述目的农杆菌菌株接种到LB液体培养基中，29°C培养，再用诱导培养基29°C培养至OD660达0.6~0.8得到。
5.如权利要求4所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于:所述诱导培养基中含乙酰丁香酮和葡萄糖和/或所述LB液体培养基中含卡那霉素和链霉素。
6.如权利要求2所述的农杆菌介导的木霉遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2)中的LB培养基中含有福利平和/或所述步骤(4)中M-100培养基中含头孢霉素。
7.一种农杆菌介导的木霉遗传转化体系，其特征是:以从PSM334质粒中回收的G418抗性基因与经过酶切并去磷酸化的载体P1300连接成的pl300-neo为载体。
【文档编号】C12N15/80GK103820487SQ201310611921
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】唐俊, 陈捷, 马越, 张雷 申请人:阜阳师范学院