一种锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过对屋尘螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要过敏原Derp2基因进行密码子优化得到优化后的基因mderp2，并以此为基础构建锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组表达质粒pNZ8148-AD和重组乳酸乳球菌L.lactis?AD（保藏号为CGMCC?No.8221）。Western?blot结果表明本发明的重组乳酸乳球菌L.lactis?AD可在菌体表面表达过敏原Derp2；同时，动物实验结果显示口服重组乳酸乳球菌L.lactis?AD可增加脾脏内调节性T细胞的水平，降低小鼠体内由屋尘螨过敏原Derp2引发的过敏反应，具有较好的预防作用。
【专利说明】一种锚定表达屋尘螨过敏原DerP2的重组乳酸乳球菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及遗传资源工程，具体涉及一种锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD及其应用。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病是临床上的常见病、多发病，是当前世界性的重大卫生学问题。其中，在引发过敏性疾病的众多吸入性过敏原中，屋尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的重要因素之一。屋尘螨是一类结构和成分复杂的生物，目前人们已从屋尘螨的数百种蛋白中初步鉴定出几十种过敏原；过敏原Derp2是其中最为主要的过敏原之一，约80%_90%的屋尘螨过敏患者对Derp2产生过敏反应。特异性免疫治疗(SIT)被认为是最有效的治疗过敏的方法，但成功的免疫治疗取决于高质量的变应原。目前，临床上用于诊断和治疗的屋尘螨粗提液含有大量非特异性杂质，严重阻碍了屋尘螨过敏原试剂的临床应用。为获得高质量的变应原，从天然产物中分离纯化过敏原(专利申请号:200410022961.9)，操作繁复且纯度不高，重复性较差；利用分子生物学技术，在大肠杆菌(专利申请号:201210139240.0)、酵母等表达系统中表达过敏原Derp2被认为是一种可行的策略，但其安全性及后续过敏原的纯化限制了这些表达系统的实际应用。
[0003]近几年，随着对乳酸菌性质的不断研究，其益生特性逐渐被人们所认识并接受，特别是在治疗一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如过敏，肠炎等，具有普通药物所不具备的优势。以乳酸菌作为表达系统，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面进行表达释放，可以有效的避免传统表达系统(大肠杆菌)所带来的安全隐患及后续抗原的纯化问题，同时避免了在口服过程中蛋白的降解和口服耐受，更能促进抗原或功能性蛋白被免疫系统所吸收等。
[0004]外源蛋白在乳酸菌中的表达方式有三种:一是目的蛋白在细胞质中表达；二是在信号肽作用下将目的蛋白分泌到培养基中；三是目的蛋白锚定在细胞壁上。将外源蛋白展示在乳酸菌表面是一种有效的研究工具并在活载体疫苗开发、诊断学、全细胞吸附剂以及新的生物催化剂等方面具有潜在应用价值。本发明通过对过敏原Derp2的天然基因进行密码子优化，构建锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD ;并验证其在预防屋尘螨过敏疾病方面的效果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基因优化的屋尘螨过敏原基因mderp2，提供一种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD (保藏号为CGMCCN0.8221)，提供将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途，提供将所述重组乳酸乳球菌L.lactis AD用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
[0006]一方面，本发明提供了一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2 的序列为 SEQ ID N0.1。[0007]所述基因优化的屋尘螨过敏原基因mderp2是通过对来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原 Derp2 的天然基因序列 SEQ ID N0.2 进行基因优化后获得的。
[0008]另一方面，本发明提供了一种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD(保藏号为CGMCC N0.8221 )，所述菌株是通过将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒PNZ8148上，构建锚定表达型质粒pNZ8148-AD，再将获得的锚定表达型质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000而获得的。
[0009]另一方面，本发明提供了将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
[0010]再一方面，本发明提供了将上述乳酸乳球菌用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
[0011]本发明涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis AD于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址(100101)北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8221。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1表示屋尘螨过敏原Derp2基因突变位点对照图。
[0013]图2表不重组乳酸乳球菌L.lactis AD中Derp2蛋白的western blot检测。
[0014]如图:最左侧为蛋白分子Marker ；1号泳道:纯化的Derp2,阳性对照；2号泳道:重组菌株L.lactis AD原生质体的细胞破碎液；3、4号泳道:阴性对照菌株L.1actis8148(不含Derp2基因)的上清液和细胞破碎液
[0015]图3表示小鼠免疫的过程。
[0016]首先进行小鼠屋尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段:首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理(200 μ I菌体或生理盐水)；在第17、24、31天进行腹腔注射Der p2/Alum (Pierce，美国)(200 μ I)的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。
[0017]图4表示口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD对小鼠体内过敏原特异性抗体的影响。
[0018]Positive:阳性对照组小鼠！Negative:阴性对照组小鼠；8148:灌胃对照菌株L.1actis8148 (不含Derp2基因)的小鼠；AD:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠;ND:灌胃重组菌株L.1actis ND(先前构建，用作对照菌株)的小鼠
[0019]图5-1表示肺部的组织形态观察(HE染色)；
[0020]图5-2表示肺部的组织形态观察(甲苯胺蓝染色)；
[0021]A:阳性对照组小鼠；B:阴性对照组小鼠；C:灌胃L.1actis8148 (空质粒)的小鼠；D:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠；
[0022]图6表示不同组别脾脏内调节性T细胞的水平
[0023]A:阳性对照组小鼠；B:灌胃重组菌株Llactis ND的小鼠；C:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠；D:阴性对照小鼠
[0024]本发明具有以下优点:
[0025]目前， 临床使用的屋尘螨变应原制剂多为通过对人工饲养的屋尘螨进行灭活处理后分离纯化得到的混合物，其成分复杂，用于SIT治疗存在着无法避免的副作用。本发明所用的乳酸菌疫苗因为乳酸菌的可食用性，不用经过灭活及纯化处理即可用于临床使用。此外，乳酸菌作为一种常见的微生物，培养及后续操作过程简单，成本较低，可以通过制成粉状制剂、胶囊等形式的药品，携带方便，无需特殊条件即可自行服用。相比传统的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易为病人所接受，同时通过口服方式更容易使机体产生免疫耐受，缩短治疗时间。
实施例
[0026]下面将结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0027]1、根据乳酸乳球菌基因组数据，分析乳酸乳球菌的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)进行密码子优化，得到可以在乳酸乳球菌内高效表达的基因mderp2，该基因的序列为SEQ IDN0.1 ； [0028]2、将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒pNZ8148(中国科学院钟瑾研究员惠赠)上，构建锚定表达型质粒PNZ8148-AD，并将质粒电转入宿主菌株L.1actisNZ9000 (中国科学院钟瑾研究员惠赠)中，得到重组菌株L.lactis AD (保藏号为CGMCCN0.8221)。
[0029]3、用Western blot检测重组乳酸乳球菌L.lactis AD中重组蛋白Derp2的表达，发现重组乳酸乳球菌L.lactis AD可在菌体表面成功表达过敏原Derp2 ；
[0030]4、动物实验结果说明，相比口服生理盐水和胞内表达过敏原的重组乳酸乳球菌的对照小鼠，口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD通过增加脾脏内调节性T细胞的水平降低实验小鼠体内Derp2特异性的IgE的水平和肺部炎症反应，抑制过敏反应。
[0031]技术细节
[0032]1、屋尘螨过敏原Derp2天然基因的优化
[0033]参照屋尘螨过敏原Derp2天然基因序列SEQ ID N0.2 (GeneBank:AF276239.1),基于乳酸乳球菌基因组的特点，根据GC含量、稀有密码子使用情况等对其进行基因优化，得到优化后的基因序列mderp2 (SEQ ID N0.1 )，人工合成后克隆到质粒pUC57 (生工生物工程(上海)有限公司)上，得到pUC57-mderp2质粒。
[0034]屋尘纟两过敏原Derp2基因优化后的基因序列mderp2:SEQ ID N0.1。
[0035]屋尘螨过敏原Derp2的原始基因序列AF276239.1:SEQ ID N0.2。
[0036]屋尘螨过敏原Derp2的氨基酸序列:SEQ ID N0.3。
[0037]2、乳酸乳球菌锚定表达质粒pNZ8148-AD的构建
[0038]以人工合成质粒pUC57-mderp2 为模板，以 8N-F’ (ggggtaccGATCAAGTTGATGTTAAAGATTGTGC)和 8N-R’ (gtctagaATCACGAATTTTAGCATGAGTAG)为引物，采用 PCR 的方法扩增目的基因 mderp2(PCR 程序为:95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；PCR 反应体系(50 μ I):5μ I dNTPs (2mM)，5 μ I 10 X Buffer, I μ I TaqE,上下游引物各 I μ 1，模板 I μ I)，PCR 产物经纯化后得到目的片段，然后以内切酶KpnI和XbaI在37°C条件下反应3小时，再经纯化处理后得到目的片段-mderp2 ;同上一步操作，以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，分别以CA-F (gtctagaGACGGAGCTTCTTCAGCTGG), CA-R (ggagctcAATAAAATAAGCATCTATG)和 SPusp45-F(cgaattcCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGC)，SPusp45-R (ggggtaccCAGCGTAAACACCTGACAAC)为引物，以PCR的方法扩增锚定蛋白基因ca (GenBank:U17696.1)和信号肽序列SPusp45(GeneBank:EU382094.1),经1%琼脂糖电泳后回收得到目的片段，分别经内切酶Xba1、SacI和Nco1、KpnI处理后得到目的片段-ca和-SPusp45 ;然后与质粒片段pNZ8148连接后得到质粒pNZ8148-AD，电转入乳酸乳球菌NZ9000中，得到重组菌株L.lactis AD (保藏号为CGMCCN0.8221)。该菌株已于2013年9月18日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保减。
[0039]3、重组乳酸乳球菌L.lactis AD中过敏原Derp2的检测
[0040]重组乳酸乳球菌L.lactis AD活化后，按1:50接种于50ml GMl7培养基(1000ml培养基:胰蛋白胨5g,大豆蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g, β -磷酸甘油二钠19g,维生素 C0.5g，lM MgSO4 1ml，葡萄糖 5g)中(含 10 μ g/ml 的氯霉素)，在 30°C培养至 OD6tltl=0.5，jjPA nisin (Sigma-Aldrich)至终浓度 10ng/ml,诱导培养 6 小时后；8000rpm 离心 5min,收集菌体。[0041]蛋白的处理:取诱导后的菌液10ml，4°C，4300g离心5min分离菌体；菌体沉淀用TES缓冲液(50mM Tris-HCl，ImMEDTA，20%蔗糖)洗涤两次；菌体用200 μ ITES-LMR缓冲液(30mg/ml溶菌酶，0.lmg/ml RNase)悬浮；37°C温浴3h，期间混匀数次，使TES-LMR充分消化细胞壁；4°C，13000g离心lOmin，取上清，菌体沉淀保存备用；上清液中加入预冷的100%TCA40 μ 1，使其终浓度为16%，以沉淀细胞壁释放的蛋白质，冰浴20min，4°C 11500g离心lOmin，弃上清液；沉淀用100 μ I 50mMNa0H悬浮，4°C作用12h后离心取上清，加入2xloadingbuffer 煮沸；
[0042]所有样品取15 μ I上样，经5-12%SDS_PAGE电泳分离后，转移至PVDF(Millipore公司，美国)膜上，分别用Derp2特异性多克隆抗体(一抗)(京天成生物技术(北京)有限公司)及HRP标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)(Thermo，美国)杂交后，加入eECL显色液(北京康为世纪生物科技有限公司)避光显色，检测结果如图2所示。
[0043]实验结果:1号泳道可检测到蛋白信号(阳性对照)，分子量大小17KDa左右；2号泳道可在43KDa位置处检测到明显的信号，与预期分子量大小类似(融合蛋白的总分子量为43KDa左右)，同时在3，4号泳道检测不到信号；结果说明过敏原Derp2蛋白可以在重组菌株L.lactis AD表面特异性表达。
[0044]4、动物实验
[0045]参见图3，进行小鼠屋尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段:首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理(200 μ I菌体或生理盐水);在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce，美国)(200 μ I)的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。
[0046]小鼠灌胃乳酸乳球菌的制备:乳酸乳球菌L.lactis AD活化后，按照1:50的比例接入GM17培养基中(加入10 μ g/ml氯霉素)进行培养，至OD=0.5左右，加入nisin至终浓度10ng/ml，30°C培养6h后，8000rpm5min离心收集菌体，用预冷的灭菌的生理盐水洗涤2遍后，加入一定体积的生理盐水，调整菌落数为lX101(lCFU/ml，取200μ I进行小鼠灌胃。
[0047]实验组的设计:[0048]阳性模型组:生理盐水灌胃，然后腹腔注射处理；
[0049]ND, AD 和 8148 组:分别用重组菌株 L.lactis ND, L.lactis AD 和 L.1actis8148(空质粒)进行灌胃，并且进行腹腔注射处理；
[0050]阴性模型组:只用生理盐水灌胃处理，然后生理盐水进行腹腔注射。
[0051]5、过敏原Derp2特异性抗体的测定
[0052]在实验结束处死小鼠时，取小鼠血液，然后室温静置2h，4000rpm离心lOmin，取上层血清，采用ELISA方法测定其中过敏原特异性抗体的浓度。
[0053]实验结果及结论:发现口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD可明显降低小鼠体内Derp2特异性IgE的浓度(参见图4A)，同时提高特异性IgG2a浓度(参见图4B);结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD可通过调整血液中特异性抗体的浓度来抑制过敏反应。
[0054](1)包被:用包被缓冲液(1000ml 含 Na2CO3L 59g ；NaHC032.93g，ph 调至 9.6)将提取的Derp2蛋白稀释到10μ g/ml，每孔加入100 μ I后4°C包被过夜。次日弃去孔内液体，用PBST (1000ml 0.1M的PBS缓冲液中加入Iml Tween20)洗涤3次，每次3min。
[0055](2)封闭:酶标板加样孔干燥后每孔加入100 μ I封闭液(Ig牛血清蛋白溶解到100ml的0.1MPBS缓冲液中)，37°C封闭2h，然后用同样方法洗涤3次。
[0056](3)加样:加100 μ I适度稀释的小鼠血清于已包被的反应孔中，分别设置空白对照和阴性对照(PBS对照组血清)，37°C保温Ih后同样方法洗涤。
[0057](4)加酶标二抗:每孔加入100 μ I新鲜稀释的酶标二抗(IgE和IgG2a)(SouthernBiotech，美国)，37°C保温lh，用PBST洗涤2次，最后用不含Tween-20的PBS洗漆一次。
[0058](5)加底物液显色:向每孔中加入新鲜配置的TMB底物溶液(北京康为世纪生物科技有限公司)，每孔100 μ 1，室温暗处静置反应15min。
[0059](6)终止反应及检测:向各反应孔中加入2M H2S0450 μ 1，轻敲酶标板使其均匀混合以终止反应，然后在15min内将酶标板置于酶标仪(Thermo，美国)上，于450nm处读取各孔的OD值。
[0060]6、肺部的组织切片
[0061]取新鲜的小鼠肺部，用生理盐水冲洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存过夜，然后用大量的清水冲洗，将多聚甲醛冲洗干净，然后用75%的乙醇保存，然后经脱水、包埋及切片染色后，用光学显微镜观察肺部的组织形态。
[0062]实验结果:通过HE染色和甲苯胺蓝染色，我们发现服用重组乳酸乳球菌L.1actisAD的实验小鼠肺部内的炎症细胞和肥大细胞的数目要远远低于阳性对照组，参见图5-1和5-2 ；
[0063]实验结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD可抑制炎症细胞在炎症部位的聚集。
[0064]7、脾脏淋巴细胞种群的分析
[0065]取新鲜的小鼠脾脏，采用机械破碎(研磨)的方法获得单细胞悬浮液，然后采用FITC标记的⑶4抗体和PE标记的Foxp3抗体进行染色(两种抗体均来源于eBioscience公司)，具体的实验操作方法为eBioscience推荐的最优方法；细胞染色后用流式细胞仪(BDBioscience)进行细胞种群的分析,如图6所示。[0066]实验结果:通过对脾脏内淋巴细胞的染色分析发现，口服重组乳酸乳球菌可以明显提高脾脏内的CD4+Foxp3+细胞的数目；此外，相比胞内表达过敏原的重组乳酸乳球菌L.1actis ND,锚定表达过敏原的重组乳酸乳球菌L.lactis AD可以刺激机体产生更多的CD4+Foxp3+ 细胞。
[0067]实验结果说明口服重组乳酸乳球菌可以通过增加免疫系统内⑶4+FoXp3+细胞的数目，抑制过敏疾病的发生；此外，过敏原在细胞表面表达比在细胞内表达具有更好的保护作用。
[0068]结论:[0069]动物实验结果说明，口服本发明的重组乳酸乳球菌L.lactis AD可通过降低小鼠血清中Derp2特异性IgE的水平、增加脾脏内CD4+FoXp3+细胞的数目及降低炎症细胞在发炎部位的聚集的方式降低实验小鼠体内的屋尘螨过敏反应；相比胞内表达过敏原的重组菌株，表面展示表达过敏原的重组菌株L.lactis AD具有更好的效果。
【权利要求】
1.一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2的序列为SEQ ID N0.1。
2.如权利要求1所述的基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，其特征在于所述过敏原基因mderp2是通过对来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2进行基因优化后获得的。
3.—种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌Lactococcuslactis AD，于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.8221。
4.如权利要求3所述的锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD，其特征在于所述菌株是通过将优化后的过敏原基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒PNZ8148上，构建锚定表达型质粒pNZ8148-AD，再将获得的锚定表达型质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000而获得的。
5.将权利要求1或2中任意一项所述的过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
6.将权利要求3或4中任意一项所述的乳酸乳球菌用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
【文档编号】C12N15/12GK103642814SQ201310646395
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】陈卫, 张秋香, 艾春青, 王刚, 田丰伟, 刘小鸣, 赵国忠, 赵建新, 张灏, 郭敏 申请人:江南大学